Bloqueio de replicação mediada por proteína repressora marcada fluorescente em Escherichia coli

Neste artigo

Resumo

Fonte: Mettrick, K. A., Lawrence, et al., Induzindo uma Obstrução de Replicação Site-Specific em E. coli Usando um Sistema de Operador Repressor Fluorescente. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra bloqueio específico do sítio do forqueta de replicação em Escherichia coli usando a expressão induzida por arabinose de TetR amarelo marcado com proteína fluorescente que se liga a matrizes cromossômicas de tetO.

Protocolo

1. Bloqueando a Replicação com Sistema de Operador de Repressor de Fluorescência (FROS)

Induzindo o bloqueio de replicação
1. Diluir uma cultura fresca durante a noite de uma cepa de E. coli transportando um arranjo tetO e pKM118 até_{OD 600}nm = 0,01 em meio complexo diluído (0,1% triptona, 0,05% extrato de levedura, 0,1% NaCl, 0,17 M_{KH 2}PO₄, 0,72 M_{K 2}_{HPO 4}) com antibióticos conforme necessário para a seleção.
  NOTA: Não adicione tetraciclina para seleção, pois ela não é compatível com este sistema. Faça o volume da cultura equivalente a 10 ml por amostra necessária. Por exemplo, o volume de cultura para o desenho experimental na Figura 1 é de 60 ml.
2. Cresca a 30 °C com agitação até OD₆₀₀ nm = 0,05-0,1. Remova uma amostra de 10 ml para servir como controle não induzido e adicione 0,1% de arabinose à cultura restante para induzir a produção de TetR-YFP a partir de pKM1. Continue cultivando tanto as culturas não induzidas quanto as induzidas. Após 1 hora, verifique a presença de um único ponto focal dentro de cada célula da cultura induzida usando microscopia de fluorescência.
3. Se as células induzidas forem confirmadas bloqueadas (mais de 70% das células têm um único foco), registre o OD_{de 600}nm e colete uma amostra de 7,5 ml para análise por gel 2D. Pegue uma amostra equivalente da cultura de controle não induzida.

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Resultados

Figura 1: Visão geral do Bloco de Replicação FROS e Procedimento Experimental de Liberação. Cepas de E. coli que transportam o conjunto tetO são cultivadas a 30 °C. Quando as células atingem um OD_{de 600}nm acima de 0,05, a pr...