Amplificação isotérmica mediada por alça para detecção de genes bacterianos

Resumo

Fonte: Domesle, K. J., et al. Amplificação isotérmica mediada por laços para triagem de Salmonella em alimentos de origem animal e confirmação de Salmonela por isolamento em cultura. J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra a técnica de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) para detectar um gene bacteriano alvo amplificando o DNA a temperatura constante. A mistura de reação é preparada adicionando uma mistura mestre isotérmica, primers específicos para o gene-alvo e amostras contendo moldes de DNA. A amplificação é iniciada em um instrumento LAMP, e a fluorescência em tempo real é monitorada para confirmar a presença do gene alvo.

Protocolo

NOTA: Uma mistura de reação de amplificação isotérmica mediada por laço (LAMP) contém DNA polimerase, tampão, sulfato de magnésio (_{MgSO 4}), trifosfatos desoxinucleotídeos (dNTPs), primers, molde de DNA e água. Os quatro primeiros reagentes estão contidos em uma mistura mestre isotérmica (Tabela de Materiais). Os primers são pré-misturados internamente para se tornarem uma mistura de primer (10 vezes). Os moldes de DNA podem ser preparados a partir de caldos de enriquecimento de amostras de alimentos animais para fins de triagem ou a partir de culturas de isolados presumidos de Salmonella para fins de confirmação. Além disso, um controle positivo (DNA extraído de quaisquer cepas de referência de Salmonella , por exemplo, Salmonella enterica serovar Typhimurium ATCC 19585 [LT2]) e um controle sem molde (NTC; água de grau molecular estéril) estão incluídos em cada execução do LAMP.

1. Preparação de modelos de DNA

1. Para preparar modelos de DNA a partir de enriquecimentos alimentares para animais, siga estes passos.
   1. Pesar assépticamente 25 g de amostra de ração animal (por exemplo, ração seca para gatos, ração seca para cães, ração para gado, ração para cavalos, ração para aves e ração para suínos) em um saco de filtro estéril (Tabela de Materiais), ou equivalente. Coloque o saco em um recipiente grande ou suporte para suporte durante a incubação.
   2. Adicione 225 mL de água peptona estéril tamponada (BPW). Misture bem com um giro e uma breve massagem nas mãos. Deixe descansar em temperatura ambiente por 60 ± 5 minutos.
   3. Misture bem rodando e determine o pH com uma folha de teste. Ajuste o pH, se necessário, para 6,8 ± 0,2 com ácido de sódio estéril 1N (NaOH) ou 1 N ácido clorídrico (HCl). Incubar a 35 ± 2 °C por 24 ± 2 horas.
   4. Misture bem girando o saco contendo caldos de enriquecimento de alimentos animais. Transfira 1 mL do lado filtrado do saco para um tubo de microcentrífuga. Vórtice brevemente.
   5. Extraia o DNA usando um reagente de preparação de amostra (Tabela de Materiais) conforme segue.
      1. Centrifuge a 900 x g por 1 minuto para remover partículas grandes e transferir o sobrenadante para um novo tubo de microcentrífuga.
      2. Centrifuge a 16.000 x g por 2 minutos e descarte o sobrenadante.
      3. Suspenda o pellet em 100 μL do reagente de preparação da amostra e aqueça a 100 ± 1 °C por 10 minutos em um bloco de calor seco.
      4. Esfrie até a temperatura ambiente e armazene os extratos de DNA da amostra a -20 °C.
2. Para preparar modelos de DNA a partir de culturas presumidas de Salmonella , siga estes passos.
   1. Obtenha isolados presumidos de Salmonella por isolamento em cultura em todos os alimentos seguindo o Capítulo 5 da FDA BAM, seção D sobre Salmonella : Isolamento de Salmonella.
   2. Inocular isolados presuntivamente de Salmonella em uma placa de ágar não seletiva (por exemplo, ágar sanguíneo, ágar nutritivo e ágar de soja tripticase) e incubar a 35 ± 2 °C por 24 ± 2 horas.
   3. Transfira várias colônias individuais para 5 mL de caldo de soja tripticase (TSB) ou caldo de infusão cerebral (BHI) e incube a 35 ± 2 °C por 16 ± 2 horas.
      NOTA: Esta etapa pode ser opcional se a cultura presumida de Salmonella for pura. Nesse caso, os moldes de DNA podem ser preparados suspendendo várias colônias individuais em 5 mL de TSB e aquecendo 500 μL da suspensão a 100 ± 1 °C por 10 minutos em um bloco de calor seco. Continue com o passo 5 abaixo.
   4. Transfira 500 μL da cultura durante a noite para um tubo de microcentrífuga e aqueça a 100 ± 1 °C por 10 minutos em um bloco de calor seco.
   5. Resfrie até temperatura ambiente e armazene extratos isolados de DNA a -20 °C.
3. Para preparar o DNA controle positivo, siga passos semelhantes aos acima para preparar modelos de DNA a partir de culturas presumidas de Salmonella , com uma etapa extra de diluição.
   1. Inocule S. Typhimurium ATCC 19585 (LT2) ou qualquer cepas de referência de Salmonella em uma placa de ágar não seletiva (por exemplo, ágar sanguíneo, ágar nutritivo e ágar de soja tripticase) e incube a 35 ± 2 °C por 24 ± 2 horas.
   2. Transfira várias colônias individuais para 5 mL de caldo TSB ou BHI e incube a 35 ± 2 °C por 16 ± 2 horas para alcançar ~10⁹ CFU/mL.
   3. Dilua serialmente a cultura durante a noite em água de 0,1% peptona para obter ~^10,7 UFC/mL.
   4. Transfira 500 μL dessa diluição para um tubo de microcentrífuga e aqueça a 100 ± 1 °C por 10 minutos em um bloco de calor seco.
   5. Esfrie até temperatura ambiente e armazene DNA controle positivo a -20 °C.

2. Preparação da mistura de primer (10x)

1. Obtenha primers LAMP comercialmente sintetizados (Sal4-F3, Sal4-B3, Sal4-FIP, Sal4-BIP, Sal4-LF e Sal4-LB) com purificação padrão por dessalinização (Tabela 1). Prepare soluções padrão de cada primer (100 μM) reidratando o primer com a quantidade adequada de água estéril de grau molecular. Misture bem por vórtice por 10 s e armazene a -20 °C (-80 °C para armazenamento a longo prazo).
2. Prepare a mistura do primer (10x) de acordo com uma folha de exercícios (Tabela 2). Adicione volumes apropriados de soluções de base de primer e água estéril de grau molecular em um tubo de microcentrífuga. Misture bem todos os reagentes fazendo vórtices por 10 segundos. Aliquota a mistura 10x do primer para 500 μL por tubo de microcentrífuga e armazene a -20 °C.

3. Montagem de uma reação LAMP

NOTA: Para evitar contaminação cruzada, é altamente recomendado separar fisicamente as áreas usadas para preparar a mistura master do LAMP e adicionar os modelos de DNA. A Figura 1 é um diagrama LAMP.

1. Preparação e configuração da corrida
   1. Lave a bancada com isopropanol e uma solução degradante de DNA e DNase (Tabela de Materiais). Limpe pipetas e suportes de tiras de tubo (Tabela de Materiais) com a solução degradante de DNA e DNase.
   2. Descongele a mistura master isotérmica, mistura de primer (10x), água de grau molecular, DNA controle positivo e moldes de DNA em temperatura ambiente.
   3. Ligue o instrumento LAMP (Tabela de Materiais) e toque na tela de abertura para acessar a tela inicial. Siga estes passos para criar uma corrida.
      NOTA: Um modelo do instrumento LAMP possui 2 blocos (A e B) com 8 amostras em cada bloco, e outro modelo tem um único bloco que acomoda 8 amostras (Tabela de Materiais).
      1. Toque LAMP+Anneal e selecione Editar para inserir informações de exemplo.
         NOTA: O perfil padrão de corrida do LAMP consiste em amplificação a 65 °C por 30 minutos e uma fase de recozimento de 98 °C a 80 °C com uma redução de 0,05 °C por segundo.
      2. Toque em cada linha de amostra para ativar o cursor e insira as informações relevantes da amostra, usando o ícone do bloco AB para alternar entre os dois blocos de instrumentos LAMP.
      3. Toque no ícone de Verificar quando todas as informações da amostra forem inseridas.
         NOTA: Opcionalmente, a configuração de execução (chamada de "Perfil", que contém informações de amostra junto com o perfil padrão de execução do LAMP) pode ser salva para uso posterior. Toque no ícone de Salvar e dê um nome único ao perfil. Ao testar esse mesmo conjunto de samples da próxima vez, uma nova execução pode ser iniciada usando o perfil salvo. Toque no ícone de Pasta no canto inferior esquerdo da tela inicial e selecione Perfil para carregar os perfis salvos.
2. Montagem de reação LAMP
   NOTA: Ao usar ambos os blocos de instrumentos LAMP (A e B, um total de 16 samples), prepare a mixagem master LAMP para 18 samples. Se estiver usando apenas um bloco de instrumento LAMP (8 samples no total), prepare a mixagem master LAMP para 10 samples. Para outros números de amostras, ajuste o volume de acordo para acomodar a perda de pipetagem. Sempre inclua um controle positivo e um NTC em cada execução do LAMP. Recomenda-se o teste duplicado de cada amostra em execuções independentes do LAMP.
   1. Prepare a mistura master do LAMP de acordo com uma folha de exercícios (Tabela 3). Adicione volumes apropriados da mistura master isotérmica, mistura de primer e água de grau molecular em um tubo de microcentrífuga e faça um vórtice suave por 3 segundos. Centrifuge brevemente.
   2. Coloque a tira de tubo no suporte da tira e distribua 23 μL da mistura master LAMP para cada poço.
   3. Faça vórtice em todos os modelos de DNA e centrifuge brevemente. Adicione 2 μL de molde de DNA ao poço apropriado e tape firmemente.
   4. Remova a tira do tubo do suporte e faça um movimento no pulso para garantir que todos os reagentes estejam acumulados no fundo do tubo.
   5. Coloque a tira de tubos no(s) bloco(s) de instrumentos LAMP, garantindo que as tampas estejam seguras antes de fechar a tampa.

4. Corrida LAMP

NOTA: Durante uma corrida LAMP, as leituras de fluorescência são adquiridas usando o canal FAM. Os valores de tempo até o pico (Tmax; min) são determinados automaticamente pelo instrumento para o momento em que a razão de fluorescência atinge o valor máximo da curva da taxa de amplificação. O Tm (°C) é a temperatura de fusão/recozimento do produto final amplificado.

1. Clique no ícone Run no canto superior direito da tela e selecione o(s) bloco(s) contendo(s) tiras de tubos para iniciar a corrida LAMP.
2. Opcionalmente, enquanto a reação está em andamento, toque nas abas Temperatura, Amplificação e Recozimento para ver as mudanças dinâmicas de vários parâmetros durante a execução do LAMP.
3. Após a execução, toque nas abas Amplificação e Recozimento para ver as curvas completas de amplificação e recozimento, e toque na aba Resultados para visualizar os resultados.
4. Opcionalmente, para registrar registros, registre o número da corrida localizado no canto superior esquerdo da tela, usando o formato "número de number_run de série do instrumento", por exemplo, "GEN2-2209_0030."

Tabela 1: Primers LAMP para triagem de Salmonella em alimentos animais e confirmação de Salmonella por isolamento em cultura. Os primers são projetados com base na sequência Salmonella invA (número de acessão GenBank M90846).

Nome de base	Descrição	Sequência (5'-3')	Comprimento (pb)
Sal4-F3	Primer externo frontal	GAACGTGTCGCGGAAGTC	18
Sal4-B3	Primer externo invertido	CGGCAATAGCGTCACCTT	18
Sal4-FIP	Primer interno frontal	GCGCGGCATCCCCGCATCAATA-TCTGGATGGTATGCCCGG	38
Sal4-BIP	Primer interno invertido	GCGAACGGCGAAGCGTACTG-TCGCACCGTCAAAGGAAC	38
Sal4-LF	Primer de laço para frente	TCAAATCGGCATCAATACTCA-TCTG	25
Sal4-LB	Primer de laço para trás	AAAGGGAAAGCCAGCTTTACG	21

Tabela 2: Planilha para preparar a mistura do primer LAMP (10x). Os primers estão listados na Tabela 1.

Componente	Conc. de estoque (μM)	Mistura de primer conc. (μM)	Volume (μL)
Primer Sal4-F3	100	1	10
Primer Sal4-B3	100	1	10
Introdução Sal4-FIP	100	18	180
Introdução Sal4-BIP	100	18	180
Primer Sal4-LF	100	10	100
Primer Sal4-LB	100	10	100
Água de grau molecular	N/A	N/A	420
Total	N/A	N/A	1000

Tabela 3: Ficha de exercícios para preparar a mistura de reação LAMP. A mistura de primers (10x) é preparada de acordo com a Tabela 2 usando soluções padrão de primers listadas na Tabela 1.

Componente	Trabalhando em conc.	Reação final conc.	Volume por amostra (μL)	Volume para 18 amostras (μL)	Volume para 10 amostras (μL)
Mistura isotérmica ISO-001 master mix	1,67x	1x	15	270	150
Mistura de primer	10x	1x	2.5	45	25
Água de grau molecular	N/A	N/A	5.5	99	55
Subtotal de mistura master	N/A	N/A	23	414	230
Molde de DNA	N/A	N/A	2	N/A	N/A

Resultados

Figura 1: Um diagrama esquemático do fluxo de trabalho Salmonella LAMP.

Materiais