Entrega por eletroporação de biomoléculas fluorescentes em células bacterianas

Resumo

Fonte: Aigrain, L., et al. Internalização e Observação de Biomoléculas Fluorescentes em Microrganismos Vivos por Eletroporação. J. Vis. Exp. (2015)

O vídeo demonstra a entrega de biomoléculas fluorescentes em células microbianas eletrocompetentes usando eletroporação. O processo começa com a introdução de DNA ou proteínas marcados com fluoróforos em uma suspensão celular resfriada. Um pulso de alta voltagem é então aplicado para criar poros temporários de membrana, permitindo a entrada da biomolécula no citoplasma. Após a recuperação, as células passam por lavagem e filtração para remover moléculas não internalizadas ou presas à superfície. Por fim, as células marcadas são montadas para imagens de fluorescência para visualizar componentes intracelulares.

Protocolo

1. Eletroporação

1. Incubação
   1. Adicione até 5 μl de moléculas marcadas armazenadas em um tampão com baixo teor de sal (< 50 mM de sal) a uma única alíquota de células competentes (bactérias de 20 μl ou leveduras de 50 μl) e incube por 10 minutos no gelo.
      NOTA: A concentração de moléculas marcadas fluorescentemente nas soluções padrão e, portanto, a quantidade de moléculas marcadas adicionadas à célula antes da eletroporação estão diretamente correlacionadas com a eficiência da carga (Figura 1 e Discussão). Como algumas proteínas são menos compatíveis com condições de baixo teor de sal, a concentração de sal no tampão de armazenamento pode ser aumentada, mas o volume de moléculas marcadas adicionadas às células antes da eletroporação precisa ser reduzido.
   2. Transfira a mistura de células e biomoléculas marcadas para uma cuveta de eletroporação pré-resfriada (espaçamento de 0,1 e 0,2 cm para bactérias e leveduras, respectivamente). Bata suavemente na cuveta na bancada para remover possíveis bolhas da solução.
   3. Coloque a cuveta no eletroporador e aplique um pulso elétrico de alta tensão à solução (0,9 a 1,8 kV/cm, veja a Discussão para mais detalhes sobre a escolha da tensão). Tal pulso forma poros transitórios nas membranas celulares, permitindo que biomoléculas marcadas difundam para dentro das células.
   4. Verifique se a constante de tempo exibida no eletroporador está entre 4 e 6 ms. Constantes de tempo mais baixas geralmente se devem à alta concentração de sal e/ou à presença de bolhas na cubeta, levando a uma carga muito baixa ou nenhuma das células.
2. Recuperação
   1. Imediatamente após a eletroporação, adicione 500 μl de meio rico, como Caldo Super Ótimo com Repressão Catabolita (SOC), Meio Definido Rico em EZ, extrato de levedura Peptona Dextrose (YPD) ou qualquer meio rico nas células.
   2. Incube a amostra a 37 °C para bactérias e 29 °C para levedura por 2 a 10 minutos. Para medições de viabilidade, onde o usuário deseja avaliar a porcentagem de células crescendo e se dividindo após a eletroporação, use um tempo de recuperação maior (até 1 hora), pois observamos esses atrasos antes da primeira divisão celular.
3. Passos de lavagem
   1. Lave as células para remover quaisquer biomoléculas não internalizadas, centrifugando as células por 1 minuto a 3300 x g e 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 500 μl de Soro Tamponado com Fosfato (PBS).
      NOTA: Para cada amostra, prepare um controle negativo das células incubadas com a mesma quantidade de biomoléculas marcadas, mas não eletroporadas e lavadas exatamente da mesma forma que a amostra principal.
   2. Repita os passos anteriores 3 vezes.
   3. No caso da internalização de proteínas, otimize o procedimento de lavagem dependendo das propriedades e do comportamento da proteína marcada de interesse. Os passos a seguir são exemplos de possíveis otimizações:
      1. Realize os três primeiros ciclos de lavagem usando PBS contendo 100 mM de NaCl e 0,005% de Triton X-100 para remover proteínas não internalizadas que possam aderir à membrana celular externa.
         1. Filtre as células eletroporadas com um filtro de 0,22 μm de diâmetro de poros instalado dentro de um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, pipetando as células eletroporadas no filtro. Centrifuge por 3 minutos a 800 x g e 4 °C. Descarte o fluxo contínuo. Adicione 500 μl de novo PBS sobre as células e as gire novamente como antes, repetindo esses passos uma vez.
      2. Adicione uma pequena quantidade de protease K (10 ng em 500 μl PBS) durante o primeiro ciclo de lavagem para permitir a digestão de qualquer proteína não internalizada.
   4. Centrifuge as células por 1 minuto a 3300 x g e 4 °C. Descarte o sobrenadante e ressuspenda as células em 150 μl de PBS.
   5. Espalhe a solução da célula carregada na almofada de agarose removendo o coverslip superior e espalhando 10 μl da suspensão da célula gota por gota. Substitua uma cobertura limpa e queimada não utilizada (sem espessura 1,5, correspondendo à especificação do objetivo do microscópio) no topo da almofada e pressione muito suavemente a lâmina.
   6. Proteja as células eletroporadas da luz armazenando as almofadas em uma caixa opaca enquanto faz imagens de diferentes amostras.

Resultados

Figura 1: Contagem do número de moléculas internalizadas usando análise de fotobranqueamento. (A) Análise de fotobranqueamento de célula única. Exemplos de traços de intensidade de fluorescência (azul: dados brutos; vermel...

Materiais