Preparação de Amostras de Myxococcus xanthus para Imagem de Células Vivas

Resumo

Fonte: Schumacher, D., et al. Imagem de Células Vivas por Fluorescência do Ciclo Celular Vegetativo Completo da Bactéria Social de Crescimento Lento Myxococcus xanthus. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a preparação e a imagem de Myxococcus xanthus, uma bactéria do solo de crescimento lento. A cultura é cultivada em meio médio, aplicada em uma cobertura com microsferas fluorescentes e recobrida com uma almofada de agarose pré-aquecida para apoiar a hidratação e o fornecimento de nutrientes. Esse sistema permite imagens ao vivo de longo prazo e em time-lapse de processos celulares durante a divisão celular bacteriana.

Protocolo

1. Preparação de Amostras de Microscopia

Nota: As células a serem observadas por microscopia são colocadas em um revestimento de microscópio e depois cobertas por uma almofada de agarose contendo nutrientes. A cobertura é colada a uma estrutura de plástico ou metal para fornecer suporte mecânico. Na preparação para a microscopia, uma grande base de 1% de agarose/TPM/0,2% CTT deve ser preparada antecipadamente, conforme descrito nos passos 2.1 a 2.3. Por favor, consulte também a Tabela de Materiais para produtos específicos usados aqui.

1. Prepare 500 mL de tampão TPM (10 mM Tris-HCl pH 7,6, 1 mM_{KH, 2}PO₄ pH 7,6, 8 mM_{MgSO 4}) e esterilize com autoclave ou filtro usando um filtro de tampo.

NOTA: O tampão estéril pode ser armazenado por vários meses em temperatura ambiente.

2. Prepare solução de microscopia de agarose a 1% contendo 0,2% de CTT (misture 1 g de agarose com 80 mL de tampão TPM e 20 mL de meio CTT a 1%). Aqueça em um micro-ondas até que a agarose esteja derretida.

NOTA: O CTT de 0,2% é suficiente para permitir o crescimento das células e evitar a fome. Concentrações mais altas de CTT no meio de microscopia resultarão em alta fluorescência de fundo.

3. Preencha uma placa de Petri com a agarose derretida até uma espessura de 0,5 cm (para uma placa de Petri de 11,5 cm x 11,5 cm quadrados, são necessários aproximadamente 60 mL de agarose derretida) e deixe esfriar até a temperatura ambiente.

NOTA: A almofada de agarose pode ser armazenada a 4 °C em um ambiente úmido por até 2 dias.

1. Pré-aqueça o absorvente de agarose/TPM/CTT a 0,2% a 32 °C por pelo menos 15 minutos antes do uso.

NOTA: Para preparar as células para microscopia, siga os passos 2.4 a 2.8.

4. Coloque uma cobertura de vidro estéril (60 mm x 22 mm, espessura: 0,7 mm) sobre uma estrutura plástica ou metálica que tenha um furo no meio (Figura 1A); Essa estrutura serve como suporte mecânico para o fino revestimento e ajuda a reduzir o desvio durante a microscopia. Fixe a cobertura na estrutura com fita.

1. Para preparar a moldura, corte uma estrutura de 75 mm × 25 mm a partir de uma placa metálica de 1 mm de espessura, depois corte um furo de tamanho adequado (20 mm × 30 mm neste experimento) no meio.

5. Adicione de 10 a 20 μL de células de M. xanthus crescendo exponencialmente no cobertor.

6. Adicionar microesferas fluorescentes de 0,5 μm como marcadores fiduciais às células para simplificar o rastreamento de células ou proteínas em registros de time-lapse.

1. Diluir as microsferas 1:100 em um tampão TPM e armazenar a 4 °C por até vários meses. Agite bem antes do uso e adicione de 5 a 10 μL das microesferas diluídas às células.

NOTA: Aqui, microsferas fluorescentes em todos os canais fluorescentes comuns azuis, verdes, amarelos e vermelhos foram usadas.

7. Corte uma pequena almofada aproximadamente do tamanho da cobertura da almofada grande pré-aquecida de agarose/TPM/0,2% CTT e coloque-a sobre as células (Figura 1B). Coloque um coverslip sobre a almofada de agarose a 1%/TPM/0,2% CTT para evitar a evaporação e manter as células em um ambiente úmido.

NOTA: O cobertor sozinho já evita evaporação significativa por pelo menos 2 horas. Para gravações de time-lapse mais longas, o pad de agarose/TPM/CTT 0,2% e o sanduíche coverslip devem ser selados com filme de parafina para evitar evaporação.

8. Incube a amostra de microscopia a 32 °C por 15 a 20 minutos para permitir que as células se fixem no fundo da almofada de agarose. Depois, comece as gravações de microscopia em time-lapse.

Resultados

Figura 1: Esquema do conjunto experimental utilizado ao longo deste estudo. (A) Uma armação de metal ou plástico serve como suporte para a amostra. Um coverslip é fixado à estrutura metálica com fita adesiva para reduzir o m...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMI6000B com o AFC	Microsistemas Leica	11888945	Microscópio automatizado de fluorescência de campo amplo invertido com controle de foco adaptativo
Quadro universal de montagem	Microsistemas Leica	11532338	Suporte de palco para diferentes tamanhos de amostra
HCX PL FLUOTAR 100x/1.30 óleo PH3	Microsistemas Leica	11506197	Objetivo de contraste de fase
Câmera Orca Flash 4.0	Hamamatsu	11532952	Câmera sCMOS de 4,0 megapixels para aquisição de imagens
Conjunto de filtros TXR ET, k	Microsistemas Leica	11504170	Conjunto de filtro de fluorescência, Exemplo: 560/40 Em: 645/75
Conjunto de filtros L5 ET, k	Microsistemas Leica	11504166	Conjunto de filtro de fluorescência, Ej: 480/40 Em: 527/30
Conjunto de filtros YFP ET, k	Microsistemas Leica	11504165	Conjunto de filtro de fluorescência, Ex: 500/20 Em: 535/30
ProScan III	Prévio	H117N1, V31XYZEF, PS3J100	Controlador de automação de microscópio com centro de controle interativo
Fonte de luz EL 6000	Microsistemas Leica	11504115	Fonte de luz de fluorescência externa
Incubadora BLX Preta	Pecon	11532830	Câmara de incubação preta ao redor do microscópio
Tempcontrol 37-2 digital	Microsistemas Leica	11521719	Controle automatizado de temperatura para câmara de incubação
Sulfato de gentmicina	Carl Roth	233.4	Gentamicina
Oxitetracilina diidratada	Sigma Aldrich	201-212-8	Oxitetraciclina
Sulfato de kanamicina	Carl Roth	T832.3	Canamicina
Filtro de tampa de garrafa Filtropur BT25 0.2	Sarstedt	831,822,101	Filtro de tampa de garrafa para esterilização de tampões
Deckgläser	VWR	630-1592	Engobe de cobertura de vidro (60 x 22 mm, espessura: 0,7 mm)
Agarose Seakem LE	Lonza	50004	Agarose para lâminas de microscopia
Leica Metamorph AF	Microsistemas Leica	11640901	Software de controle de microscópio e software para análise de imagens
Microsperas de Tetraspeck, 0,5 μm	ThermoFisher	T7281	Microsferas fluorescentes
Placa de Petri	Greiner Bio-one	688102	Placa de Petri quadrada de 120 mm x 120 mm x 17 mm para almofadas de agarose
BD Bacto Casitone	Becton Dickinson	225930	Casitone
Parafilm M	VWR	291-1213	Parafilm
Tris(hidroximetil)-aminometano	Carl Roth	AE15.2	Tris
Sulfato de magnésio heptahidratado	Carl Roth	P027.2	Sulfato de magnésio
Fosfato dihidrogênio de potássio p.a.	Carl Roth	3904.1	Dihidrofosfato de potássio
Meio CTT 1%: 1% (v/p) BD Bacto™ casitona, 10 mM Tris-HCl ph 8,0, 1 mM tampão fosfato de potássio pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Meio de cultivo para M. xanthus
Tampão TPM: 10 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM tampão fosfato de potássio pH 7,6, 8 mM MgSO₄			Buffer para preparação de lâminas de microscopia para M. xanthus