Análise precisa e de alta capacidade do crescimento bacteriano usando um leitor de microplacas

Resumo

Fonte: Kurokawa, M., et al. Análise precisa e de alta produtividade do crescimento bacteriano. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a quantificação de alto rendimento do crescimento bacteriano usando um leitor de microplacas. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação da cultura, medição de densidade óptica e análise da dinâmica do crescimento.

Protocolo

1. Registro em tempo real do crescimento
   1. Desenhe um pictograma de placa de 96 poços (tabela 8 × 12) para indicar as posições das amostras de cultura inoculadas na placa de 96 poços. Imprima a tabela e use-a como referência para o experimento.
      NOTA: Os poços localizados nas bordas da microplaca devem conter apenas meio em branco devido à evaporação.
   2. Coloque uma microplaca esterilizada de fundo plano de 96 poços com tampa, pontas de pipeta P-1000 e 1000 μL, pontas de pipeta P-200 e 200 μL, vários microtubos de 1,5 mL, uma pipeta multicanal de 8 canais, um reservatório de reagente esterilizado, M63 em temperatura ambiente e os estoques de glicerol de Escherichia coli em uma bancada limpa.
   3. Adicione aproximadamente 25 mL de M63 ao reservatório do reagente. Use este estoque de reservatório para todas as etapas a seguir.
   4. Adicione 900 μL de M63 aos microtubos em preparação para a realização de diluições seriadas.
   5. Descongele o estoque de glicerol em temperatura ambiente. Adicione 900 μL de M63 ao estoque de glicerol descongelado e ao vórtice. Isso resulta em uma diluição de 10 vezes o estoque original de glicerol.
   6. Transfira 100 μL da diluição de 10 vezes para outro microtubo contendo 900 μL de M63 e vórtice. Isso resulta em uma diluição de 100 vezes.
   7. Repita o passo 1.6 até atingir o número desejado de diluições.
   8. Preencha os poços na borda da microplaca com 200 μL M63 usando uma pipeta de 8 canais (P-200).
      NOTA: Esses poços podem ser usados como blank.
   9. Carregue 200 μL de cada amostra diluída preparada nos passos 1.4 - 1.7 para os poços de microplacas de acordo com a tabela de referência (passo 1.1). Faça vórtice nas amostras diluídas antes de carregar e carregue a mesma amostra em múltiplos poços em locais variados na placa.
   10. Coloque a microplaca de 96 poços no leitor de placa.
   11. Abra "Leia Agora" no "Gerenciador de Tarefas" e escolha o programa. Clique em "OK" para começar a medir. Salve a gravação como um novo arquivo experimental para análise de dados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fosfato de dipotássio	Wako	164-04295
Fosfato de monopotássio	Wako	166-04255
Sulfato de amônio	Wako	019-03435
Sulfato de magnésio heptahidratado	Wako	138-00415
Tiamina-HCl	Wako	201-00852
Glicose	Wako	049-31165
Hcl	Wako	080-01066
Sulfato de ferro (II) heptahidratado	Wako	094-01082
KOH	Wako	168-21815
Glicerol	Wako	075-00611
Pontas de pipeta, 200 μL	WATSON	110-705Y
Pontas de pipeta, 1.000 μL	WATSON	110-8040
Microtubo (1,5 mL)	WATSON	131-715C
8 pipeta multicanal	WATSON	NT-8200
Agitador Pasorina	COMO UM SÓ	2-4990-02
Cilindro de vidro (200 mL)	COMO UM SÓ	1-8562-07
Medidor de pH de precisão	COMO UM SÓ	AS800 / 1-054-01
Pipetman P-200	GILSON	1-6855-05
Pipetman P-1000	GILSON	1-6855-06
Suporte para microtubos	Biografia da BM	801-02Y
Vórtice	Biografia da BM	BM-V1
Microplaca Corning Costar de 96 poços com tampa (fundo plano, transparente)	Sigma-Aldrich	Corning, 3370
Reservatório de reagente Corning Costar (50 mL)	Sigma-Aldrich	Corning, 4870
EPOCH2	BioTek	2014-EP2-002 / EPOCH2T
Bancada limpa de BIO	Panasonic	MCV-B131F
Cepas bacterianas	Organização de bancos de cepa; Projeto Nacional de Recursos Biológicos (NBRP) no Japão