Análise precisa e de alta capacidade do crescimento bacteriano usando um leitor de microplacas

Abstract

Fonte: Kurokawa, M., et al. Análise precisa e de alta produtividade do crescimento bacteriano. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a quantificação de alto rendimento do crescimento bacteriano usando um leitor de microplacas. Ele descreve as etapas envolvidas na preparação da cultura, medição de densidade óptica e análise da dinâmica do crescimento.

Protocol

1. Registro em tempo real do crescimento
   1. Desenhe um pictograma de placa de 96 poços (tabela 8 × 12) para indicar as posições das amostras de cultura inoculadas na placa de 96 poços. Imprima a tabela e use-a como referência para o experimento.
      NOTA: Os poços localizados nas bordas da microplaca devem conter apenas meio em branco devido à evaporação.
   2. Coloque uma microplaca esterilizada de fundo plano de 96 poços com tampa, pontas de pipeta P-1000 e 1000 μL, pontas de pipeta P-200 e 200 μL, vários microtubos de 1,5 mL, uma pipeta multicanal de 8 canais, um reservatório de reagente esterilizado, M63 em temperatura ambiente e os estoques de glicerol de Escherichia coli em uma bancada limpa.
   3. Adicione aproximadamente 25 mL de M63 ao reservatório do reagente. Use este estoque de reservatório para todas as etapas a seguir.
   4. Adicione 900 μL de M63 aos microtubos em preparação para a realização de diluições seriadas.
   5. Descongele o estoque de glicerol em temperatura ambiente. Adicione 900 μL de M63 ao estoque de glicerol descongelado e ao vórtice. Isso resulta em uma diluição de 10 vezes o estoque original de glicerol.
   6. Transfira 100 μL da diluição de 10 vezes para outro microtubo contendo 900 μL de M63 e vórtice. Isso resulta em uma diluição de 100 vezes.
   7. Repita o passo 1.6 até atingir o número desejado de diluições.
   8. Preencha os poços na borda da microplaca com 200 μL M63 usando uma pipeta de 8 canais (P-200).
      NOTA: Esses poços podem ser usados como blank.
   9. Carregue 200 μL de cada amostra diluída preparada nos passos 1.4 - 1.7 para os poços de microplacas de acordo com a tabela de referência (passo 1.1). Faça vórtice nas amostras diluídas antes de carregar e carregue a mesma amostra em múltiplos poços em locais variados na placa.
   10. Coloque a microplaca de 96 poços no leitor de placa.
   11. Abra "Leia Agora" no "Gerenciador de Tarefas" e escolha o programa. Clique em "OK" para começar a medir. Salve a gravação como um novo arquivo experimental para análise de dados.

Materials