Avaliação da atividade bacteriana de chaperona por meio do desdobramento térmico de uma proteína modelo

Resumo

Fonte: Dahl, J. et al. Detecção da atividade dependente de pH de Escherichia coli Chaperona HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra um ensaio baseado em espectrofotômetro de fluorescência para avaliar a atividade de chaperonas em uma proteína substrato sob estresse ácido e térmico. Ele descreve as etapas para monitorar o desdobramento e agregação do substrato por meio da dispersão da luz, comparando condições com e sem o acompanhante.

Protocolo

1. Ensaio de Atividade de Chaperona Usando Desidrogenase Malato Termo-Desdobramento (MDH)

NOTA: A influência do HdeB purificado na agregação da desidrogenase mitocondrial mitocondrial (MDH) porquina, que se desenrola termicamente, em diferentes valores de pH foi monitorada conforme descrito abaixo. Todas as concentrações listadas de proteínas referem-se à concentração de monômeros.

1. Para preparar o MDH, dialise o MDH a 4 °C durante a noite contra 4 L de tampão C (50 mM fosfato de potássio, 50 mM cloreto de sódio (NaCl), pH 7,5) e concentre a proteína até aproximadamente 100 μM usando unidades de filtro centrífugo com corte de peso molecular de 30 kDa.
   NOTA: É necessária diálise cuidadosa do MDH, pois o MDH é administrado em solução de sulfato de amônio.
2. Para remover agregados, centrifuge a proteína por 20 min a 20.000 x g a 4 °C. Determine a concentração de MDH por absorção em 280 nm (ε_{280 nm} = 7.950 ^{M-1 cm-1}). Prepare alíquotas de 50 μl de MDH e congele rapidamente as alíquotas para armazenamento.
3. Coloque uma cuveta de quartzo de 1 ml em um espectrofotômetro de fluorescência equipado com suportes e agitadores de amostra controlados por temperatura. Ajuste λ_ex/em para 350 nm.
4. Adicione volumes apropriados de tampão pré-aquecido (43 °C) D (150 mM fosfato de potássio, 150 mM NaCl) nos valores de pH desejados (aqui: pH 2,0, pH 3,0, pH 4,0 e pH 5,0) à cuveta e ajuste a temperatura no suporte da cuveta para 43 °C. O volume total é de 1.000 μl.
5. Adicione 12,5 μM de HdeB (ou, alternativamente, o mesmo volume de buffer de armazenamento HdeB para o controle do buffer) ao buffer, seguido pela adição de 0,5 μM MDH. Comece a monitorar a dispersão da luz. Incube a reação por 360 segundos para permitir o desdobramento suficiente do MDH.
6. Aumente o pH para 7 adicionando 0,16-0,34 volume de 2 M sem buffer_{K 2}HPO₄ e continue registrando a dispersão da luz por mais 440 segundos.
7. Ajuste a extensão da agregação de MDH registrada na ausência do acompanhante em um momento definido após a neutralização (daqui em diante 500 segundos, quando a máxima dispersão da luz do MDH foi observada) em 100%. Normalize a atividade do HdeB ao sinal de espalhamento da luz do MDH na ausência de HdeB em cada valor de pH indicado.

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