Avaliação do Papel Protetor de uma Chaperona Ativada por Ácido em E. coli sob E. Coli sob Estresse Ácido

Resumo

Fonte: Dahl, J., et al. Detecção da atividade dependente de pH de Escherichia coli Chaperona HdeB In Vitro e In Vivo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra o uso de culturas recombinantes de E. coli para avaliar o efeito protetor de uma acompanhante ativada por ácido durante o estresse ácido. O monitoramento do crescimento bacteriano revela maior sobrevivência em culturas que expressam chaperonas em comparação com os controles, destacando o papel das chaperonas na estabilização proteica sob condições de estresse.

Protocolo

1. Efeito da superexpressão de HdeB da chaperona na sobrevivência de E. coli sob estresse ácido

NOTA: O DNA genômico da E. coli MG1655 foi isolado usando protocolo padrão.

1. Amplifique o chaperone hdeB de E. coli MG1655 por PCR usando primers hdeB-BamH I-rev GGT GGT CTG GGA GGA TCC TTA ATT CGG CAA GTC ATT e hdeB-EcoR I-fw GGT GCC GAA TTC AGG AGG CGC ATG ATG ATT TCA TCT CTC C.
2. Prepare a reação PCR em 50 μl da seguinte forma: 10 μl 5x tampão de polimerase, 200 μM dNTPs, 0,5 μM primer JUD2, 0,5 μM primer JUD5, 150 ng de DNA genômico MG1655, 0,5 μl DNA polimerase, adicione_{ddH 2}O a 50 μl.
3. Realize a amplificação do hdeB da seguinte forma: Passo 1: 5 min a 95 °C, 1 ciclo; passo 2: 30 segundos a 95 °C, 30 segundos a 55 °C, 30 segundos a 72 °C, 40 ciclos; Passo 3: 10 minutos a 72 °C.
4. Clone o fragmento de PCR resultante nos sítios EcoRI e BamHI do plasmídeo pBAD18 usando métodos padrão para clonagem de sítios de restrição. Purifique o plasmídeo usando um kit de purificação de plasmídeos conforme as instruções do fabricante. Verifique o plasmídeo resultante por sequenciamento.
5. Transforme o plasmídeo que expressa HdeB ou o controle de vetor vazio pBAD18 na cepa BB7224 (ΔrpoH) (genótipo: F^-, λ^-, e14^-, [araD139]_B/r Δ(argF-lac)169 flhD5301 Δ(fruK-yeiR)725(fruA25) relA1 rpsL150(Sm^R) rbsR22 Δ(fimB-fimE)632(::IS1) ptsF25 zhf::Tn10(Tc^S) suhX401 deoC1 araD⁺ rpoH::kan⁺) usando células quimicamente competentes.
   NOTA: Essa cepa é sensível à temperatura.
6. Após um choque térmico de 45 segundos a 42 °C e antes da blindagem, incube as células a 30 °C e 200 rpm. Realize estrias em colônia única dos clones positivos e incube durante a noite a 30 °C. Prepare uma cultura durante a noite em 50 ml LB_Amp e cultive as células a 200 rpm e 30 °C.
7. Diluir culturas durante a noite 40 vezes em 25 ml LB_Amp e aumentar a bactéria na presença de 0,5% de arabinose (Ara) a 30 °C e 200 rpm até uma _O.D.600nm = 1,0 para induzir a expressão da proteína HdeB.
8. Para os experimentos de deslocamento de pH, use LB_Amp+Ara para diluir as células a uma O.D.600nm de 0,5 e ajuste aos respectivos valores de pH (aqui: pH 2,0, pH 3,0 e pH 4,0) adicionando volumes apropriados de 5 M HCl.
9. Após os pontos de tempo indicados (pH 2, 1 min; pH 3, 2,5 min; pH 4, 30 min), neutralize as culturas adicionando os volumes apropriados de 5 M de NaOH.
10. Monitore o crescimento das culturas neutralizadas em cultura líquida por 12 horas a 30 °C usando medições de overdose.

Materiais