Extração de DNA Genômico Baseada em Lisis Térmica de uma Bactéria Patógena

Resumo

Fonte: Gulla, S., et al. Análise em Tandem-Repetição Multi-locus da Bactéria Yersinia ruckeri com patígenos de peixes por PCR multiplex e eletroforese capilar. J. Vis. Exp. (2019).

Esse protocolo extrai DNA genômico da Yersinia ruckeri suspendendo colônias isoladas em água ultrapura e aplicando calor para lisar as células. A centrifugação separa o sobrenadante contendo DNA dos detritos celulares, produzindo DNA molde adequado para genotipagem baseada em PCR e análise epidemiológica.

Protocolo

1. Cultivo e extração bacteriana de DNA genômico

1. Semeie culturas puras de Y. ruckeri em qualquer tipo de ágar adequado (os autores usaram ágar sanguíneo bovino a 5%) e incube a 22 °C por 1-2 dias, ou 15 °C por 3-4 dias.
2. De cada placa de ágar, escolha uma única colônia representativa com um laço de inoculação e transfira para tubos centrífugos de 1,5 mL contendo 50 μL de água ultrapurificada. Suspenda, faça vórtice brevemente e incube por 7 minutos em um bloco de aquecimento a 100 °C.
3. Centrifuge a 16.000 x g por 3 minutos e use uma pipeta para transferir cuidadosamente o sobrenadante para um tubo vazio de 1,5 mL. Prossiga para a próxima etapa usando o sobrenadante como DNA modelo ou armazene a -20 °C até esse momento.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora 22°C/15°C	Como preferir.	NA
Centrífuga(s)	Como preferir.	NA
Tubos Eppendorf Safe-Lock, 1,5 mL	Eppendorf	30120086	Tubos centrífugas usados durante a extração de DNA.
Freezer	Como preferir.	NA
Bloco de aquecimento	Como preferir.	NA
Água Milli-Q	NA	NA	Água purificada usada durante PCR e eletroforese capilar. Receita padrão; produzido internamente.
Cultura pura da ruckeri de Yersinia	NA	NA	Por exemplo, criopreservado ou fresco.
Vórtice	Como preferir.	NA