Detecção de patógenos de peixes usando análise de repetição em tandem de número variável (VNTR)

Abstract

Fonte: Gulla, S., et al. Análise em Tandem-Repetição Multi-locus da Bactéria Yersinia ruckeri com patígenos de peixes por PCR multiplex e eletroforese capilar. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra o procedimento para separar amplificações de repetição em tandem de número variável marcadas fluorescentemente (VNTR), derivadas de uma bactéria patogênica de peixes, usando eletroforese capilar para gerar perfis eletroferográficos específicos de tamanho para identificação bacteriana.

Protocol

1. Configuração e Condições de Funcionamento da Eletroforese Capilar

1. Após confirmação dos amplicons de PCR (reação em cadeia da polimerase), diluir os produtos de PCR 1:10 (v/v) em água purificada. Vede, misture e centrifuge brevemente.
2. Trabalhando em uma armaria de fumo, prepare um volume de mistura master consistindo em 9 μL de formamida e 0,5 μL de tamanho padrão por produto de PCR (permitir 10% de volume excedente). Vortex brevemente e distribui 9,5 μL em poços em uma placa apropriada para o sistema CE (eletroforese capilar) disponível, antes de adicionar 0,5 μL de produto de PCR diluído. Vede, misture e centrifuge brevemente.
   CUIDADO: Manuseie com cuidado. Misturar formamida com água gera ácido fórmico, que é tóxico.
3. Usando um ciclador térmico de PCR, desnatureie as amostras a 95 °C por 3 minutos antes de resfriar para 4 °C indefinidamente. Centrifuge brevemente e coloque a placa em um sistema CE calibrado conforme as instruções do fabricante.
4. Execute a análise de fragmentos CE usando reagentes conforme apropriado para o aparelho escolhido e as seguintes configurações: 60 °C; 5 s injeções a 1,6 kV (32 V por cm); Tempo de funcionamento de 32 min a 15 kV (300 V por cm). A análise de fragmentos de CE em 24 poços em um 24-capilares (50 cm) normalmente leva aproximadamente 50 minutos.

Materials