Exposição de uma comunidade bacteriana oral sintética a fases simuladas da digestão

Resumo

Fonte: Arroyo, M. C., et al. Avaliação da Viabilidade de um Consórcio Bacteriano Sintético na Interface In Vitro Intestino-Microrganismo. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a avaliação da viabilidade de uma comunidade microbiana oral sintética durante a simulação da digestão oral, gástrica e intestinal. A sobrevivência bacteriana é quantificada após cada fase, revelando um declínio progressivo devido ao estresse digestivo.

Protocolo

1. Sobrevivência bacteriana após condições de trânsito gastrointestinal in vitro

NOTA: Prepare fluidos de digestão simulados com as modificações descritas abaixo. Prepare todas as diluições com água ultrapura. Esterilize todas as soluções através de um filtro de 0,22 μm e realize o procedimento de digestão em condições estéreis.

1. Digestão oral:
   1. Coloque 3 mL da comunidade bacteriana em um tubo estéril de 50 mL, misture com 3 mL de fluido salivar simulado (SSF), contendo em milimoles por litro (mmol L⁻¹): cloreto de potássio (KCl), 15,1; Fosfato de monopotássio (KH₂PO₄), 3,7; Bicarbonato de sódio (NaHCO₃), 6,8; Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl₂·6H₂O), 0,5, carbonato de amônio [(NH₄)₂CO₃], 0,06; Ácido clorídrico (HCl), 1.1; Diidratado de cloreto de cálcio (CaCl₂·2H₂O), 0,75. Adicione 75 U/mL de α-amilase da saliva humana Tipo IX-A e 2 g/L de mucina do estômago suíno (Tipo II) ao SSF.
   2. Incube a mistura por 2 minutos a 37 °C e 100 rpm. Colete uma amostra de 2 mL para extração de DNA e quantificação por citometria de fluxo (S1).

2. Digestão gástrica:

1. Adicione 4 mL de líquido gástrico simulado (SGF), contendo (em mmol L-1): KCl, 6,9; KH₂PO₄, 0,9; NaHCO₃, 25; Cloreto de sódio (NaCl), 47,2; MgCl₂·6H₂O, 0,1, (NH₄)₂CO₃, 0,5; HCl, 15,6; CaCl₂·2H₂O, 0,075. Além disso, o SGF continha 2 g/L de mucina proveniente do estômago suíno (Tipo II).
2. Meça o pH e ajuste para pH 3 com 1 molar (1 M) de HCl, se necessário. Incube a 37 °C e 100 rpm. Colete uma amostra de 2 mL (S2).

3. Digestão do intestino delgado:

1. Adicionar 4 mL de fluido intestinal simulado (SIF) contendo (em mmol L-1): KCl, 6,8; KH₂PO₄, 0,8; NaHCO₃, 85; NaCl, 38,4; MgCl₂·6H₂O, 0,33; HCl, 8.4; CaCl₂·2H₂O, 0,3, para o tubo digestivo.
2. Ajuste para pH 7 com 1 M de hidróxido de sódio (NaOH), se necessário. Incube a 37 °C e 100 rpm. Colete uma amostra de 2 mL (S3).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mucina do estômago suíno Tipo II	Sigma-Aldrich	M2378
PBS	Gibco	14190250
Millipore Milli-Q acadêmico, sistema de água ultra pura	Millipore, Merck KGaA	-
Incubadora InnOva 4080	New Brunswick Scientific	8261-30-1007
Água livre de nuclease	Eletroforese Serva	28539010
Citômetro de fluxo BD Accuri C6	BD em Biociências	653118
Kit InnuPREP PCRpure	Analytik Jena	845-KS-5010250	Kit de purificação PCR