Ensaio de sobreposição de ágar macio para detectar morte mediada por bacteriocina em Pseudomonas syringae

Resumo

Fonte: Hockett, K. L. e Baltrus, D. A. Uso da técnica de sobreposição de ágar mole para rastrear compostos inibitórios produzidos por bactérias. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o procedimento para detectar a morte mediada por bacteriocina ao detectar sobrenadante de uma cepa doadora induzida por antibiótico sobre uma sobreposição de ágar mole contendo uma cepa teste. Zonas claras formadas após a incubação indicam inibição bacteriana.

Protocolo

1. Preparação de sobreposições e testes de supernadantes para atividade

1. Inocule uma única colônia de uma cepa de P. syringae para ser testada quanto à sensibilidade em 3 ml de KB (médio de King's B), incube durante a noite com agitação em temperatura ambiente.
2. Na manhã seguinte, dilua a cultura 1/100 para a água fresca. Incube por 3-4 horas com agitação em temperatura ambiente.
3. Prepare ágar de água esterilizado autoclavando uma suspensão de ágar de 0,35-0,7% (p/v) em água ultrapura.
   NOTA: Um estoque de ágar de água macia pode ser derretido em um micro-ondas e reutilizado repetidamente; Uma nova sobreposição não precisa ser preparada para cada experimento. Se o ágar de água for reutilizado, é fundamental garantir que ele esteja completamente derretido após o micro-ondas. Se não, a sobreposição terá uma textura granulada ao solidificar, o que dificultará a interpretação.
4. Antes do uso, mantenha o ágar mole derretido em um banho-maria a 60 °C. Utilizando uma pipeta sorológica estéril, transfira 3 ml de ágar mole para um tubo de cultura estéril. Retorne o tubo de cultura ao banho-maria para manter o estado fundido.
5. Para despejar a sobreposição, primeiro deixe o ágar derretido esfriar (deve parecer quente, mas não quente ao toque), mas não deixe que solidifique.
6. Em um capuz estéril, inocule 100 μl da cultura da cepa testadora no ágar mole e no vórtice para misturar. Gire a cultura manualmente por 10-15 segundos, depois despeje sobre um ágar inferior (ágar KB). Incline a placa em todas as direções para garantir que o ágar mole cubra uniformemente o ágar inferior.
   NOTA: O ágar inferior pode ser qualquer meio solidificado (1,5% ágar) no qual a cepa de teste cresça vigorosamente. Para uma placa de Petri padrão de 100 mm de diâmetro, use ~20 ml de meio derretido. O ágar de fundo pode ser preparado várias semanas antes (se mantido a 4 °C sem secar) ou pode ser preparado no mesmo dia.
7. Cubra o prato e deixe solidificar por 20 a 30 minutos. Tome cuidado para não mexer na placa enquanto ela solidifica.
8. Uma vez solidificado, coloque 2-5 μl de sobrenadante na sobreposição. Deixe as placas incubarem durante a noite em temperatura ambiente. Observe e registre os resultados na manhã seguinte.
   NOTA: Pode ser útil realizar e identificar a partir de uma diluição serial do sobrenadante. Isso permitirá que os pesquisadores distinguam entre a atividade de eliminação de bacteriófagos e bacteriocina. Nesse caso, recomenda-se realizar diluições 1:5 ou 1:10.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mitomicina C	Santa Cruz Biotecnologia	SC-3514	Cancerígeno. Use EPI adequado (ou seja, luvas, proteção para os olhos e máscara facial), especialmente ao preparar a solução padrão.
Ágar de grau bacteriológico	Genesee Scientific	20-274