Isolamento de Bactérias Adaptadas ao Estresse por Seleção de Colônia Única

Resumo

Fonte: Jeong, H., et. al. Procedimento para Evolução Laboratorial Adaptativa de Microrganismos Usando Quimóstato. J. Vis. Exp. (2016).

Este vídeo demonstra o isolamento seletivo e o crescimento de bactérias adaptadas ao estresse de uma cultura exposta a condições prolongadas de estresse. A cultura é placada sobre ágar contendo estressor, e uma única colônia é selecionada para inocular um meio líquido com o estressor. A absorvância é medida em intervalos regulares para monitorar o crescimento e confirmar o isolamento bem-sucedido das bactérias adaptadas ao estresse.

Protocolo

1. Preparação de Equipamentos

1. Obtenha um pote de quimostato (150-250 ml) ou um frasco Erlenmeyer (250 ml) contendo uma entrada de entrada e uma de saída. Conecte as portas com tubos de silício, permitindo vazões de 10-100 ml/h. Opcionalmente, use uma saída de ar, uma saída de ar e portas de entrada e saída de água com controle de temperatura.
2. Adquira um dispositivo adequado para o pote de quimostato que permita agitação e controle de temperatura (ou utilize uma incubadora rotativa de agitação).
3. Obtenha duas bombas peristálticas para fornecer meio fresco e coletar a cultura.
4. Obtenha um jarro reservatório (10-20 L) contendo uma porta de saída média e uma entrada de ar.
5. Obtenha tubos de silício adequados para a taxa de diluição (ou seja, ID 0,8 mm, faixa de fluxo 0,06-36 ml/min; L/S 13 tubos).

2. Preparação e esterilização do meio

1. Meio Inicial
   1. Dissolva 0,3 g de glicose, 0,08 g de cloreto de amônio (NH₄Cl), 0,05 g de cloreto de sódio (NaCl), 0,75 g de fosfato de hidrogênio dissódico (Na₂HPO_{4,2H 2}O) e 0,3 g de diidrato de hidrogênio dissódico (_{KH 2}PO₄) em 90 mL de água destilada (D.W.) em um pote de quimostó.
   2. Sele o pote de quimostato junto com o tubo usando grampos. Não vede a saída de ar.
   3. Esterilize o pote do quimostato em um autoclave a 121 °C por 15 minutos. Após a esterilização, armazene o pote de quimostato em temperatura ambiente.
   4. Dissolva 0,02 g de sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO 4,7H₂O), 0,01 g de cloreto de cálcio (CaCl₂) e 0,1 mg de tiamina em 10 mL de diámetro (solução A).
   5. Filtre a solução A usando uma seringa e um filtro de seringa pré-esterilizado (um filtro de poros de 0,45 μm).
   6. Adicione o filtrado solução A ao pote de quimostato.
2. Meio de Tensão
   1. Dissolva 30 g de glicose, 8 g de NH₄Cl, 5 g de NaCl, 75 g de_{Na 2HPO 4}·2H₂O, 30 g de_{KH 2}PO₄ e 300 g de succinato dissódico hexahidratado (Na₂·succinato·6H₂O; o estressor usado neste experimento) em 9,9 L D.W. em um frasco reservatório.
   2. Sele o pote do reservatório junto com o tubo usando grampos. Não vede a saída de ar.
   3. Esterilize o pote reservatório em uma autoclave a 121 °C por 15 minutos. Após a esterilização, armazene o pote em temperatura ambiente.
   4. Dissolva 2 g de MgSO_{4,7H 2}O, 1 g de_{CaCl 2} e 10 mg de tiamina em 100 ml de D.W. (solução A).
   5. Solução filtrante A com seringa e filtro de seringa pré-esterilizado (filtro poroso de 0,45 μm).
   6. Adicione o filtrado A da solução ao pote reservatório.
   7. Conecte assépticamente o tubo de silício esterilizado ao pote reservatório e conecte as bombas peristálticas.
3. Meio de alta tensão
   1. Prepare o meio como na seção 2.2, mas com uma concentração maior de estressor (ou seja, 3-5 g/L maior na adaptação succinada).
      Nota: Este protocolo é para adaptação a uma tensão que pode ser aplicada pelo meio. No caso de fatores físicos como temperatura, agitação ou iluminação, o cultivo deve ser projetado de acordo.

3. Cultivo Inicial

1. Inocule uma única colônia de Escherichia coli do tipo selvagem (E. coli) em um tubo de ensaio de 15 ml contendo 4 ml de meio inicial.
2. Incube o tubo de ensaio em uma incubadora agitada por 12 horas a 37 °C e 220 rpm.
3. Transfira assépticamente 1 ml de pré-cultura para o pote de quimosto.
4. Incube o pote do quimosotato, que permite aeração (ar 50 ml/min) e agitação (200 rpm), a 37 °C por 6 horas.

4. Adaptação ao Estresse

1. Conecte assépticamente a extremidade do tubo de silício das bombas ao pote de quimosto.
2. Ligue a bomba de saída (10 ml/h ou mais) e colete a cultura. Nota: A cultura deve estar em fase exponencial, tipicamente 4-8 horas após o cultivo inicial.
3. Verifique a densidade óptica (600 nm) da cultura do tubo de saída.
4. Ligue a bomba de entrada (10 ml/h, correspondendo a uma taxa de diluição de 0,1 h-1).
5. Verifique a densidade óptica da cultura a 600 nm a partir do tubo de saída a cada 24 horas.
6. Opere o quimostato por 96 horas (9,6 vezes de rotatividade) ou mais. Se a densidade óptica for estável, troque o reservatório contendo o meio de alta tensão. Se a densidade óptica for menor que 0,2, pare a bomba de entrada por 6 horas. Reinicie a bomba de entrada e verifique se a densidade óptica está acima de 0,2.
7. Aumente gradualmente a concentração do estressor mudando para um reservatório contendo uma concentração maior de estressor.
8. Pegue amostras da cultura adaptada sempre que ela atinga um marco (por exemplo, uma cepa adaptada a 100 g/L de estresse succinado) e armazene-as para análises genômicas adicionais.
9. Para armazenamento da amostra, misture a amostra de cultura (0,5 ml) com uma solução esterilizada de glicerol de 80% (0,5 ml) e armazene-a a -80 °C. Nota: Se o microrganismo adquirir a capacidade de degradar o estressor durante o processo de ALE, a concentração do estressor no pote de fermentação não é a mesma que na reserva fresca.

5. Isolamento de colônia única da Tensão adaptada ao estresse

1. Prepare um meio em placa de ágar (1,6% de ágar) contendo o mesmo estressor e na mesma concentração de meio.
2. Coloque a cultura de saída (0,1 ml) do quimiostato e incube a 37 °C por 16 horas.
3. Retire colônias individuais da placa usando um palito de dente estéril e inocule-as em tubos de ensaio de 15 ml contendo o mesmo estressor e na mesma concentração média do quimosato, e incube por 6 horas.
4. Transfira 1 ml de caldo de cultura para um frasco Erlenmeyer de 250 ml contendo 50 ml de meio. Colhe 0,5 ml do caldo de cultura a cada 1 hora e meça a dose em 600 nm. Compare a taxa de crescimento da deformação adaptada com a da deformação do tipo selvagem, dado o fator de estresse.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Fermentador de mini-quimostratos	Biotron Inc.	-	Fabricado por encomenda especial
Tubo de silício	Cole-Parmer	Masterflex L/S 13	O tamanho dos tubos pode variar dependendo da taxa de diluição e do tamanho do pote fermentador.
Jarro reservatório	Bellco	Garrafa de armazenamento para mídia	20 L
Produtos químicos	Sigma-Aldrich	-	Grau de reagente
Glicose	Sigma-Aldrich	G5767	Reagente ACS
NH₄Cl	Sigma-Aldrich	A9434	para biologia molecular, adequado para cultura celular, ≥99,5%
NaCl	Sigma-Aldrich	746398	Reagente ACS, ≥99%
Na₂HPO₄·2H₂O	Sigma-Aldrich	4272	98.5-101%
KH₂PO₄	Sigma-Aldrich	795488	Reagente ACS, ≥99%
MgSO₄·7H₂O	Sigma-Aldrich	230391	Reagente ACS, ≥98%
CaCl₂	Sigma-Aldrich	793639	Reagente ACS, ≥96%
Tiamina·HCl	Sigma-Aldrich	T4625	grau de reagente, ≥99%
Na₂succinate·6H₂O	Sigma-Aldrich	S2378	ReagentPlus, ≥99%