1. Coleta e armazenamento de água e corais para isolamento microbiano
NOTA: É essencial registrar as coordenadas e a temperatura dos locais de amostragem. Se possível, metadados como salinidade, pH, profundidade e intensidade luminosa também podem ajudar a encontrar abordagens de cultivo ajustadas e a interpretação futura dos dados. Para resultados confiáveis, mantenha as amostras armazenadas pelo menor tempo possível. Os microbiomas da água/coral podem mudar consideravelmente se as amostras não forem mantidas na temperatura adequada e/ou armazenadas por longos períodos. Se a etapa de isolamento não for realizada imediatamente após a coleta, é crucial manter as amostras a 4 °C até o processamento. Quanto mais tempo as amostras permanecem armazenadas, mesmo a 4 °C, mais a comunidade microbiana muda.
- Amostre e armazene água do mar.
- Colete 500 mL amostras de água em pelo menos triplicado de cada local de amostragem alvo. De preferência use frascos estéreis com tampas de rosca.
- Se for processar a água imediatamente após a coleta, mantenha as garrafas em RT por um curto intervalo. Se o processamento da amostra for ocorrer depois, mantenha as garrafas a 4 °C.
- Amostre e armazene o coral.
- Use um alicate estéril para cortar fragmentos de coral do mesmo local de amostragem das amostras de água. Para evitar contaminação, toque corais apenas com luvas estéreis.
- Enxágue o fragmento de coral amostrado usando solução salina estéril de 20 mL (3% de NaCl em água destilada) ou água do mar artificial para eliminar as bactérias livres e soltas da água do mar.
- Usando pinças, coloque cada fragmento de coral em um recipiente estéril de 250−500 mL com uma tampa de rosca contendo solução salina estéril.
- No laboratório, usando pinças e alicates estéreis, pesem 5 g de fragmentos de coral usando placas de Petri estéreis de 100 mm x 20 mm em uma balança.
- Transfira os 5 g de amostra de coral para um almofariz estéril e macere usando um pilão estéril.
- Usando uma espátula estéril, transfira a amostra macerada para um frasco de cultura estéril contendo 45 mL de solução estéril de NaCl a 3% e 10−15 contas de vidro de 5 mm. Use um pouco da solução salina estéril de 45 mL para lavar o argamassa e recuperar a quantidade máxima do macerado.
- Mantenha os frascos sob agitação constante (150 x g) por 16 h à temperatura da água do local de amostragem.
NOTA: Para corais de águas rasas, a temperatura ideal variará de 24 a 28 °C. Essa etapa irá separar microrganismos de diferentes compartimentos de coral, como aqueles ligados às células hospedeiras ou aqueles que vivem dentro do tecido e do esqueleto. Após essa etapa, os macerados de coral não devem ser armazenados, e a etapa de isolamento deve ser realizada instantaneamente.
2. Isolamento de bactérias sintéticas degradadoras de estrogênio 17a-etinilestradiol (EE2) de água do mar e/ou corais
- Selecione bactérias.
NOTA: Após os passos 1.1.2 e 1.2.7, a concentração de microrganismos na água do mar que se desprenderam dos diferentes macerados de coral será desconhecida e variável. Para garantir o isolamento de colônias microbianas individuais em placas de Petri contendo meio de ágar, são necessárias diluições em série.- Realize diluições seriadas de até 10-9 em solução salina estéril para amostras de coral e até 10-6 para amostras de água. A pipeta dilui para cima e para baixo 5 vezes antes de descartar a ponta. Amostra de vórtice por 5 s toda vez antes de realizar a próxima diluição seriada.
- Pipete 100 μL de cada diluição em placas de Petri contendo meio de ágar de caldo de lisogênica NaCl (LB) a 3% e prepare-as.
NOTA: Use ágar marinho (MA) como meio alternativo. Três plicas de cada diluição são necessárias para resultados confiáveis. - Incube as placas por 1 a 3 dias na temperatura de-um (por exemplo, 26 °C). Confira as placas uma vez por dia.
- Selecione e isole as colônias que apresentam morfologias de crescimento distintas em novas placas usando a técnica de placas de estria. Repita essa etapa quantas vezes for necessário para que colônias puras crescam nas placas.
- Se o procedimento não for imediatamente continuado até a etapa 2.3.1, armazene os isolados a 4 °C ou em glicerol conforme descrito na seção 2.2.
- Prepare estoques de glicerol.
NOTA: Essa etapa é opcional e pode ser usada para armazenamento de estoques bacterianos a longo prazo.- Retire colônias individuais da placa fresca ou das placas armazenadas a 4 °C e inocule-as independentemente em 2 mL de meio LB estéril.
- Coloque os tubos sob agitação constante (150 x g) a 24−28 °C durante a noite (ON).
- Adicione 1 mL das culturas bacterianas do passo 2.2.2 e glicerol estéril a uma concentração final de 20% para os 2 mL de crioviais.
- Deixe os cryovials LIGADOS a 4 °C.
- Coloque os estoques de glicerol bacteriano a -80 °C até ser necessário.
- Realize o teste de habilidade de degradação EE2.
- Ative os isolados no caldo LB ou em meios alternativos. Para isso, escolha uma colônia única das placas frescas ou da placa armazenada a 4 °C, e inocule 2 mL de meio LB estéril. No caso de ser um estoque de glicerol, primeiro faça uma escrasca em placas de ágar LB e incube a 24−28 °C ON para que colônias individuais cresçam. Coloque o tubo contendo o meio LB inclinado sob agitação constante (150 x g) a 24−28 °C ON.
- Após o crescimento bacteriano, faça pellets nas células centrifugando-as a 8.000 x g por 8 minutos em temperatura ambiente (RT). Descarte o sobrenadante e, pipetando suavemente para cima e para baixo, ressuspenda as células em volume igual (2 mL) de água salina para lavar o caldo LB restante.
- Repita o passo 2.3.2 duas vezes para garantir que não haja vestígios de fonte de carbono, ressuspendendo as células em volume igual de solução salina. Por exemplo, se foi iniciada com uma cultura de 2 mL, ressuspenda as células em um volume final de solução fisiológica de 2 mL.
- Inocule as células lavadas e ressuspensas em meio de cultivo Haas Bushnell mínimo (BH Broth) contendo EE2 como única fonte de carbono.
NOTA: O EE2 é dissolvido em etanol a uma concentração final de 5 mg/L no meio de cultura. Faça alterações no tipo e/ou concentração de poluentes, se necessário. - Avalie o crescimento bacteriano por densidade óptica a 600 nm e/ou colônias formando unidades (CFU) em meio de ágar LB, durante 16−72 horas de incubação.
NOTA: Alternativamente, os microrganismos podem ser isolados diretamente em meios mínimos contendo EE2 ou outros compostos como única fonte de carbono. Essa etapa direcionaria a seleção e evitaria um crescimento indesejado.