Enriquecimento seletivo e isolamento de bactérias marinhas degradadoras de óleo a partir de amostras de água do mar

Resumo

Fonte: Villela, H. D. M. , et al. Prospectação de Cepas Microbianas para Biorremediação e Desenvolvimento de Probióticos para Pesquisa e Preservação de Metaorganismos. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o isolamento seletivo de bactérias marinhas degradadoras do petróleo ao enriquecer amostras de água do mar em meios à base de petróleo, possibilitando a recuperação de cepas puras com potencial de aplicações na biorremediação de petróleo bruto e limpeza ambiental.

Protocolo

1. Coleta e armazenamento de água e corais para isolamento microbiano

NOTA: É essencial registrar as coordenadas e a temperatura dos locais de amostragem. Se possível, metadados como salinidade, pH, profundidade e intensidade luminosa também podem ajudar a encontrar abordagens de cultivo ajustadas e a interpretação futura dos dados. Para resultados confiáveis, mantenha as amostras armazenadas pelo menor tempo possível. Os microbiomas da água/coral podem mudar consideravelmente se as amostras não forem mantidas na temperatura adequada e/ou armazenadas por longos períodos. Se a etapa de isolamento não for realizada imediatamente após a coleta, é crucial manter as amostras a 4 °C até o processamento. Quanto mais tempo as amostras permanecem armazenadas, mesmo a 4 °C, mais a comunidade microbiana muda.

1. Amostre e armazene água do mar.
   1. Colete 500 mL de amostras de água em pelo menos triplicado de cada local de amostragem. De preferência, use frascos estéreis com tampas de rosca.
   2. Se for processar a água imediatamente após a coleta, mantenha as garrafas em temperatura ambiente (RT) por um curto período. Se o processamento da amostra for ocorrer depois, mantenha as garrafas a 4 °C.
2. Amostre e armazene o coral.
   1. Use um alicate estéril para cortar fragmentos de coral do mesmo local de amostragem das amostras de água. Para evitar contaminação, toque corais apenas com luvas estéreis.
   2. Enxágue o fragmento de coral amostrado usando 20 mL de solução salina estéril (3% de NaCl (cloreto de sódio) em água destilada) ou água do mar artificial para eliminar as bactérias livres e frouxamente aderidas à água do mar.
   3. Usando pinças, coloque cada fragmento de coral em um recipiente estéril de 250−500 mL com uma tampa de rosca contendo solução salina estéril.
   4. No laboratório, usando pinças e alicates estéreis, pesem 5 g de fragmentos de coral usando placas de Petri estéreis de 100 mm x 20 mm em uma balança.
   5. Transfira os 5 g de amostra de coral para um almofariz estéril e macere usando um pilão estéril.
   6. Usando uma espátula estéril, transfira a amostra macerada para um frasco de cultura estéril contendo 45 mL de solução estéril de NaCl a 3% e 10−15 contas de vidro de 5 mm. Use um pouco da solução salina estéril de 45 mL para lavar o argamassa e recuperar a quantidade máxima do macerado.
   7. Mantenha os frascos sob agitação constante (150 x g) por 16 h à temperatura da água do local de amostragem.
      NOTA: Para corais de águas rasas, a temperatura ideal variará entre 24 e 28 °C. Essa etapa irá separar microrganismos de diferentes compartimentos de coral, como aqueles ligados às células hospedeiras ou aqueles que vivem dentro do tecido e do esqueleto. Após essa etapa, os macerados de coral não devem ser armazenados, e a etapa de isolamento deve ser realizada instantaneamente.

2. Isolamento de bactérias degradadoras de óleo da água do mar e/ou corais

1. Prepare um meio mínimo contendo uma fração solúvel em óleo em água (oWSF) e fração insolúvel em água em óleo (oWIF) como única fonte de carbono.
   1. Adicione 1−2% de petróleo bruto a 500 mL de água destilada estéril. Use um frasco filtrante aberto no fundo para retirar a fração solúvel sem perturbar a camada superior da fração insolúvel.
   2. Mantenha a mistura sob agitação constante a 24−28 °C a 150 x g por 48 horas.
   3. Coloque o frasco filtrante contendo as frações de petróleo bruto em uma superfície estável e espere 10−20 minutos para permitir a separação das frações solúvel e insolúvel.
   4. Transfira o oWSF para um novo frasco estéril, salvando o oWIF ao abrir o frasco inferior do filtro e retirar a fração solúvel.
   5. Usando todo o oWSF recuperado na etapa anterior (~400 mL), prepare 1 L de meio BH (Bushnell Haas) com mínimo de ágar contendo oWSF como única fonte de carbono.
   6. Usando o oWIF restante no frasco do passo 2.1.4, prepare 1 L de meio de ágar mínimo BH contendo oWIF como única fonte de carbono.
2. Isole bactérias degradantes de oWSF e oWIF.
   1. Utilizando água e macerado de coral das etapas 1.1.2 e 1.2.7, respectivamente, dilua as amostras até ^10-6 em solução salina estéril, conforme abaixo.
3. Realize diluições seriadas de até ^10-9 em solução salina estéril para amostras de coral e até ^10-6 para amostras de água. A pipeta dilui para cima e para baixo 5 vezes antes de descartar a ponta. Amostra de vórtice por 5 s toda vez antes de realizar a próxima diluição seriada.
4. Pipete 100 μL de cada diluição em placas de Petri contendo meios de ágar BH-oWSF e BH-oWIF e os emplatre.
5. Incube as placas por 1 a 3 dias na temperatura de-um (por exemplo, 26 °C). Confira as placas uma vez por dia.
6. Selecione e isole as colônias que apresentam morfologias de crescimento distintas em novas placas usando a técnica de placas de estria. Repita essa etapa quantas vezes for necessário para que colônias puras crescam nas placas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Garrafa de armazenamento de mídia PYREX de 500 mL	thomas scientific/Corning	1743E20/1395-500	Usava para amostrar água.
Frascos aspiradores de 500 mL	thomas scientific/Corning	1234B28/1220-2X	Usado para separar as frações de óleo.
Alicate de corte de arame de 6 polegadas	thomas scientific/Restek	1173Y64/23033	Usado para cortar fragmentos de coral.
Ágar	Himídia	PCT0901-1KG	Usava para fazer mídia sólida.
Caldo Haas de Bushnell	Himídia	M350-500G	Usado como meio mínimo para ser complementado com fontes de carbono.
Frasco Erlenmeyer	Thomas Scientific/DWK Ciências da Vida (Kimble)	4882H35/26500-125	Usado para incubar macerados de coral com contas de vidro.
Exaustor de Fluxo Laminar			Precisava trabalhar em condições estéreis.
Luria Bertani Broth, Miller (Miller Luria Bertani Broth)	Himídia	M1245-1KG	Usado como meio rico para cultivar bactérias.
Ágar Marinho 2216 (Ágar Marinho Zobell)	Himídia	M384-500G	Usado como meio rico para cultivar bactérias.
Incubadora de Agitadores Orbitais			Usado para incubar meios líquidos e óleo.
Incubadora de Placas			Usado para incubar placas.
Almofariz e pilão de porcelana	Thomas scientific/United Scientific Supplies	1201U69/JMD150	Usado para macerar fragmentos de coral.
Centrífuga refrigerada			Usado para centrifugar culturas bacterianas.
Espectrofotômetro			Usado para medir a densidade óptica de culturas bacterianas.
Kit de Purificação de DNA Genômico Wizard	Promega	A1120	Usado para extração de DNA de cepas microbianas.