Monitorando o crescimento bacteriano em resolução de célula única em um sistema microfluídico

Resumo

Fonte: Cabeen, M. T., et al. Análise Microfluídica de célula única de Bacillus subtilis. J. Vis. Experiência (2018)

O vídeo demonstra o uso de um dispositivo microfluídico para observar o crescimento bacteriano em nível de célula única. Ele mostra como células bacterianas não móveis, confinadas em trincheiras em microescala, são continuamente nutridas e visualizadas sob um microscópio de fluorescência. A configuração permite visualização em tempo real da divisão celular e do rastreamento de linhagem ao longo de várias gerações.

Protocolo

1. Casting de Dispositivos PDMS

1. Em ambiente sem poeira, misture polidimetilsiloxano (PDMS) e agente de cura em uma proporção de 10:1 e desgase sob vácuo por pelo menos 10 minutos.
2. Coloque um mestre de silício (ou uma réplica de epóxi ou poliuretano desse modelo) sobre um pedaço de folha de alumínio intacta em uma placa de Petri de poliestireno. Despeje a mistura desgaseificada de PDMS sobre o mestre até uma profundidade de aproximadamente 5 mm. Desgase a placa de Petri por pelo menos 10 minutos. Use um fluxo suave de ar para quebrar as bolhas da superfície.
   NOTA: Uma réplica plástica master pode flutuar parcialmente durante o desgaseificação; Se isso acontecer, pressione a réplica com um aplicador plástico limpo.
3. Cure o PDMS por pelo menos 1 hora no forno a 60 °C e esfrie até a temperatura ambiente. Remova o papel alumínio contendo o mestre e o PDMS curado da placa de Petri. Cuidadosamente retire o papel alumínio da parte de trás do master e depois retire cuidadosamente o PDMS do master.
   NOTA: Alternativamente, o PDMS pode ser curado durante a noite em temperatura ambiente. A relativa fragilidade de um mestre de pastilha de silício pode ser superada usando adesivo epóxi para fixar permanentemente a pastilha a um disco de alumínio de 1/16 de polegada de espessura, do mesmo tamanho da pastilha.
4. Como uma pastilha normalmente inclui vários dispositivos microfluídicos com dimensões ligeiramente diferentes, corte um único dispositivo no tamanho usando um bisturi limpo e afiado.
   NOTA: Para trabalhos rotineiros com Bacillus subtilis , use dispositivos com trincheiras de células de 1,0 μm de largura.

2. Perfuração e Ligação de Dispositivos

1. Coloque um pedaço de fita translúcida de escritório (veja Tabela de Materiais) sobre o lado padronizado do dispositivo para melhorar a visibilidade dos traços padronizados. As portas de entrada e saída são identificadas como áreas circulares em extremidades opostas dos canais fluídicos visíveis (Figura 1). Para melhorar a visibilidade deles ao furar os pinos de entrada e saída do aparelho, marque as entradas e saídas com pontos usando um marcador de ponta fina.
   NOTA: Para garantir que os pinos de entrada e saída não fiquem sobrecarregados, cada canal é perfurado, começando pelo canal logo abaixo do designador alfabético do dispositivo.
2. Vire o dispositivo PDMS de modo que o lado padrão fique para baixo e perfure o dispositivo até os pontos marcados usando um perfurador de biópsia de 0,75 mm; Descarte os perfuradores.
   NOTA: Os dispositivos são perfurados com o lado padrão para baixo porque o orifício gerado pelo punção de biópsia normalmente é levemente alargado onde o punção entra no polímero. Colocar o dispositivo em uma orientação invertida garante que o furo do lado padronizado tenha uma borda nítida.
3. Usando um estereoscópio, certifique-se de que os furos perfurados sobreponham-se às áreas de entrada e saída do dispositivo. Use pinças de ponta fina para remover quaisquer fragmentos extras de PDMS dos furos perfurados.
4. Use fita adesiva para remover a poeira dos dois lados do dispositivo e coloque-a em uma placa de Petri de poliestireno limpa. Prepare um copo de cobertura de 22 mm x 40 mm umedecendo com álcool isopropílico 100% e esfregando com um lenço de sala limpa; seca com um jato de ar livre de poeira ou nitrogênio.
5. Coloque o dispositivo PDMS perfurado com o lado para cima junto com o vidro limpo dentro de um limpador de plasma de oxigênio.
   1. Trate o dispositivo com plasma com as seguintes configurações: vácuo, 70 mTorr; Pressão O₂, 200 mTorr; duração, 15 s; potência, 30 W. Imediatamente após o término do período de tratamento com plasma, remova o dispositivo e cubra o vidro do limpador de plasma.
   2. Inverta o PDMS e posicione-o no centro do vidro da cobertura para que o lado padronizado toque o vidro; Certifique-se de que os canais de alimentação (que correm entre as áreas de entrada e saída) estejam alinhados com o eixo longo do vidro de cobertura. Pressione muito suavemente para garantir que o PDMS vede contra o vidro.
6. Asse o dispositivo montado em um forno por pelo menos 1 hora a 60 °C. Após o assamento, verifique manualmente se o PDMS está colado ao vidro pressionando suavemente um canto do dispositivo.
   NOTA: Uma vez que o dispositivo está colado, ele deve ser usado em até 24 horas, pois o polímero se tornará cada vez mais hidrofóbico com o passar do tempo após o tratamento com plasma.

3. Preparação de Encanamento Microfluídico

1. Corte os comprimentos do tubo de polímero (diâmetro interno (DI) 0,02 polegada, diâmetro externo (OD) 0,06 polegada) para comprimentos apropriados para alcançar da bomba da seringa até o aparelho de comutação (se utilizado) e o dispositivo quando montado no microscópio. Corte quantos comprimentos houver em faixas microfluídicas.
2. Monte junções em Y para válvulas de pinça (se usadas) cortando e fixando comprimentos de 2 cm de tubo flexível de silicone (0,03 polegada DI, 0,065 polegada OD) nas barbas superiores do "Y" e comprimentos de tubo de silicone de 1 cm na barba inferior do "Y".
3. Cortar comprimentos de 10 cm (ou apropriados) de tubo de polímero; conecte-os em uma extremidade à junção do interruptor inserindo-os nos segmentos de tubo de silicone de 1 cm na espiga inferior do "Y". Conecte-as na outra ponta a agulhas de 21G que foram retiradas dos adaptadores plásticos da seringa e dobradas aproximadamente 90° em cerca de 9 mm da ponta da agulha.
4. Conecte agulhas rombas de 21G em uma extremidade dos segmentos do tubo que irão das seringas até o aparelho de interruptor, inserindo as agulhas no tubo. Insira as outras extremidades de cada trecho de tubo nos segmentos de tubo de silicone nas farpas de entrada das junções em Y.
   NOTA: Use algum tipo de aparelho para segurar as válvulas de pressão e as junções no lugar; isso pode ser facilmente feito a partir de uma caixa de ponta de micropipeta (Figura 2D).
5. Corte pedaços de tubo de polímero para transportar resíduos da saída do dispositivo até um béquer de resíduos. Conecte-as em uma das extremidades a agulhas 21-G dobradas preparadas conforme descrito acima. Prenda a outra ponta dos tubos em um béquer de lixo.
6. Prepare volumes apropriados de meio contendo 0,1 mg/mL de albumina sérica bovina (BSA) e encha o tamanho e número desejados de seringas. Conecte as seringas carregadas com BSA às agulhas preparadas de 21G acopladas ao tubo de entrada e coloque as seringas nas bombas de seringa.
   NOTA: Para experimentos típicos, são usados 5 canais do dispositivo, cada um com uma seringa de 20 mL. Um experimento em que o meio é trocado exigirá 2 bancos de 5 seringas cada. Aqui, a bomba contendo o primeiro banco é chamada de bomba de fase 1, e a bomba contendo o segundo banco, com o meio pós-comutação, é chamada de bomba de fase 2.
7. Purge o ar da tubulação de entrada operando as bombas de seringa a uma alta vazão (>500 μL/min), começando orientando as bombas de seringa verticalmente e batendo nas seringas para trazer bolhas de ar para o topo. Depois de o ar ser purgado das seringas, coloque a bomba da seringa na horizontal e gradualmente bata ou estale as linhas de polímero das seringas através do aparelho de interruptor para desalojar e eliminar as bolhas de ar. Repita esse processo para o segundo banco de seringas (se estiver trocando de meio).
8. Após a purga das bolhas de ar, ajuste a bomba de seringa de fase 2 (ou seja, com o meio que será usado em segundo, após a troca) para 1,5 μL/min, e então pause o fluxo. Coloque pequenos clipes de ligante nos segmentos de tubo flexível no ramo das junções em Y correspondentes à segunda fase do meio. Continue operando a bomba de seringa de fase 1 a uma vazão modesta (por exemplo, 10 μL/min) por pelo menos 30 minutos para purgar o segundo meio do tubo de entrada a jusante da junção em Y.

4. Preparação de Cultura Celular

1. Cultive uma pré-cultura da cepa de interesse no meio desejado da noite para o dia, até a fase estacionária. A cepa bacteriana deve conter uma mutação que torne as células imóveis, para que elas não nadem para fora dos canais do dispositivo.
   NOTA: Neste protocolo, a cepa bacteriana é B. subtilis 3610, contendo uma substituição A233V por bruxa(essa mutação faz com que o flagelo seja reto em vez de helicoidal, impedindo a motilidade celular), um repórterP rsbV-mNeonGreen para estresse celular, e um repórter constitutivo Phyperspank-mNeptune (vermelho) para destacar células. O meio Lennox Luria-Bertani (LB) é usado no protocolo de exemplo. Cepas típicas para experimentos de microfluídica contêm um ou mais repórteres transcricionais fluorescentes e uma proteína fluorescente citoplasmática produzida constitutivamente para facilitar a detecção automatizada das células. Defeitos de crescimento não foram observados quando o meio rico em LB Lennox foi utilizado, mas o crescimento de B. subtilis em meio mínimo pode ser inibido sob condições microfluídicas porque sideróforos secretados são lavados pelo fluxo do meio. Nessas circunstâncias, o crescimento pode ser restaurado pela adição de citrato de sódio e cloreto férrico ao meio, conforme relatado para o meio S750.
2. Na manhã do experimento, dilua as células de B. subtilis por 1:50 em um frasco defleitor de 250 mL contendo 25 mL de meio de crescimento. Cultive as células por 5 a 6 horas em cultura agitada a 37 °C até uma densidade óptica superior a 1.
   NOTA: Uma cultura celular densa é preferível porque as células de B. subtilis em fase estacionária são menores e menos encontradas nas cadeias celulares, facilitando a carga do dispositivo. Diferentes espécies bacterianas podem necessitar de outros meios ou condições de crescimento para a carga ideal.
3. Usando uma seringa equipada com um filtro do tamanho de um poro de 5 μm, filtre aproximadamente 15 mL de cultura celular em um tubo cônico de 15 mL para remover as cadeias celulares de B. subtilis (isso é desnecessário para E. coli e pode não ser necessário em outras espécies).
   NOTA: Relativamente poucas células devem ser removidas; O filtrado deve ser turvo.
4. Centrifuge a cultura filtrada por 10 minutos a 4.000 x g em temperatura ambiente. Despeje o sobrenadante e resuspenda a célula no fluido sobrenadante residual restante no tubo, adicionando aproximadamente 500 μL de meio fresco, se necessário, para facilitar a pipeteação da suspensão celular.

5. Carregamento de Dispositivo

1. Coloque suavemente pontas vazias e finas de micropipeta de carregamento em gel (veja Tabela de Materiais) nos orifícios de saída do dispositivo microfluídico.
2. Usando pontas finas de gel com micropipeta P200, passive o dispositivo injetando um meio contendo 1 mg/mL de BSA nos orifícios de entrada, observando as pontas nos orifícios de saída para monitorar o enchimento dos canais microfluídicos (Figura 2A). Incube o dispositivo em temperatura ambiente por aproximadamente 5 minutos.
   NOTA: A BSA é comumente usada como agente bloqueante ou passivante que se liga à superfície hidrofóbica do polímero PDMS, aumentando sua hidrofilicidade e reduzindo a ligação de outras proteínas ou das células (via moléculas da superfície celular).
3. Usando pontas finas de carregamento em gel, carregue cada canal com as células ressuspensas (da Seção 4), usando as pontas no canal de saída para monitorar o progresso das células pelo dispositivo (Figura 2B).
   NOTA: A carga é facilitada ajustando a micropipeta P200 ao seu volume máximo de 200 μL e então aspirando uma almofada de ar antes de aspirar um pequeno volume (aproximadamente metade do volume da seção fina da ponta da pipeta) de células. O volume das células ressuspensas não precisa ser preciso, pois o volume do dispositivo PDMS é pequeno em relação ao da micropipeta. Não conhecemos nenhum limite superior para a densidade das células ressuspensas, desde que a suspensão celular possa ser pipetada no dispositivo. Aglomerados celulares podem entupir o dispositivo e devem ser evitados por meio de pipeteamento cuidadoso e/ou mistura de vórtice.
4. Remova suavemente as ponteiras de gel dos furos de saída, trabalhando uma de cada vez para evitar danos ao dispositivo.
5. Centrifuge o dispositivo em uma microcentrífuga de bancada em um adaptador de rotor apropriado a aproximadamente 6.000 x g por 10 minutos (Figura 2C).
   NOTA: Foi utilizado um adaptador de rotor de alumínio usinado sob medida, projetado para caber em um rotor de microcentrífuga (Figura 2C); diferentes modelos de centrífugas podem ser usados com adaptadores de rotor apropriados. A característica importante do adaptador é que ele fornece força lateral na direção das extremidades fechadas das valas das células, forçando as células para os canais laterais.
6. Verifique o carregamento bem-sucedido sob o microscópio (Figura 3), mas sem fixar o dispositivo ao suporte da lâmina/inserto do palco.
   NOTA: Neste protocolo, uma objetiva de imersão em óleo Ph3 de 60X e 1,4 NA é usada tanto para verificação nesta etapa quanto para imagens subsequentes.

6. Montagem, Equilíbrio e Montagem do Dispositivo

1. Monte cuidadosamente o dispositivo carregado em um inserto de palco colando o vidro da cobertura de cada lado do PDMS na parte inferior do inserto de palco (ou seja, inverta o inserto de palco antes de prender o dispositivo). Inverta o conjunto do dispositivo de inserção do estágio para que o PDMS fique voltado para cima e posicione-o sobre uma superfície macia, como uma limpeza sem poeira (Figura 2D).
2. Ajuste a vazão da bomba de seringa de fase 1 para 35 μL/min. Trabalhando com uma pista por vez, insira a agulha de entrada e depois a agulha de saída (ou seja, indo até o béquer de resíduo; Figura 2E).
3. Limpe qualquer excesso de meio com um lenço limpo e sem poeira e inspecione visualmente o aparelho para detectar vazamentos. Examine o tubo de saída para a aparência de células excedentes (tipicamente aparecendo como uma faixa turva) e o menisco médio, que se move lentamente em direção ao béquer de resíduos.
4. Permita que o dispositivo funcione a 35 μL/min por aproximadamente 15 a 30 minutos, até que todas as faixas conectadas estejam drenando para o vaso de resíduos.
5. Ajuste a bomba de seringa de fase 1 para 1,5 μL/min e pause o fluxo. Leve toda a bomba e o aparelho do dispositivo ao microscópio (esse processo é facilitado ao colocar tudo em um carrinho rodante) e reinicie o fluxo do meio fase 1 a 1,5 μL/min. Monte cuidadosamente o inserto do palco com o dispositivo em um microscópio de fluorescência invertida, usando fita adesiva conforme necessário para encaminhar a tubulação de entrada e saída.
6. Localize as posições desejadas no dispositivo para a imagem e comece a obter a imagem conforme desejado. Note que as células normalmente requerem algumas horas (aproximadamente 10 gerações) para alcançar crescimento exponencial em estado estacionário, e o início da aquisição da imagem pode ser atrasado conforme desejado, de modo que a imagem comece após o período de equilíbrio.
   NOTA: O crescimento em estado estacionário das células mantidas em fase exponencial deve ser verificado durante análises subsequentes de imagem, acompanhando os tempos de divisão celular e garantindo que atingiram um valor mínimo constante.

Resultados

Figura 1: Esquema do dispositivo microfluídico. O esquema do dispositivo é mostrado aproximadamente em escala. O designador alfabético está rotulado junto com as zonas de entrada e saída que são perfuradas para conectar as agulhas de ponta ...

Materiais