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1. Condições de cultura bacteriana
- Trabalhando sob um exaustor de fluxo laminar, utilize 100 μL de um estoque de glicerol de proteína fluorescente verde ( GFP) marcada com Pseudomonas putida KT2440 (1 × 107 mL-1, armazenada a -80 °C) para inocular 5 mL de meio Luria-Bertani (LB). Incube a 30 °C enquanto agita a 250 rpm durante a noite.
- No dia seguinte, resuspenda 100 μL da cultura durante a noite em meio de 5 mL LB e incube sob as mesmas condições por 5h (fase exponencial). Amostre uma alíquota de 1 mL em um tubo de 2 mL, deixe esfriar até a temperatura ambiente (~15 min) e centrifuge (2300 x g por 5 min).
- Remova o sobrenadante e adicione 1 mL de buffer de motilidade ao pellet. Vortex brevemente para homogeneizar a amostra. Dilua para atingir a concentração celular desejada, por exemplo, 5 x 105 mL-1.
- Para experimentos envolvendo comunidades naturais, como aquelas derivadas de riachos, prepare um meio de cultivo não seletivo. Por exemplo, use água de riacho filtrada e autoclavada por estéril ou um meio artificial de água de riacho emendado com uma fonte de carbono complexa (meio LB).
2. Preparação de um dispositivo microfluídico em polidimetilsiloxano (PDMS)
- Projete a geometria porosa desejada por meio de software de desenho assistido por computador (CAD), que consiste em uma matriz de círculos (isto é, o obstáculo impermeável ao fluxo), descrita pelo tamanho do raio e pelas coordenadas do centro.
NOTA: Um exemplo de geometria porosa com granulação e tamanhos de poros aleatórios é fornecido na Figura 1A. Um canal de observação sem obstáculos próximos à saída facilita a aquisição de curvas de ruptura (BTCs). - Com base na geometria escolhida, prepare um molde usando fotolitografia padrão SU-8.
NOTA: Alternativamente, moldes também podem ser encomendados de uma instalação dedicada à microfabricação. Para obter fluxo de fluido heterogêneo no plano horizontal, é importante projetar a espessura da câmara de microfluídica da mesma ordem de magnitude do tamanho médio da garganta dos poros. No entanto, certifique-se de que as dimensões do dispositivo microfluídico sejam adequadas para observação ao microscópio (por exemplo, trabalho em lâminas de microscópio). - Prepare 50 g de PDMS adicionando 10% de reticulador (dimetil, copolímero de metilhidrogênio siloxano) a 90% do elastômero em peso, usando uma seringa sem agulha. Trabalhe em condições limpas e evite poeira o máximo possível. Misture os dois reagentes em um recipiente limpo e descartável e aplique vácuo (100 mbar) por 30 minutos para remover o ar dissolvido e as bolhas do PDMS viscoso.
- Coloque o molde em uma placa de Petri (100 mm de diâmetro, 15 mm de altura). Despeje o PDMS sobre o molde até a altura desejada (por exemplo, 2-5 mm). Cubra a placa de Petri e mantenha-a a 60 °C por 4 horas (durante a noite para as camadas mais grossas) para curar.
NOTA: Para fins de visualização, a luz deve poder passar pelo PDMS; assim, uma camada fina entre 2 mm e 5 mm é desejável. Camadas mais grossas (>5 mm) reduzem a transparência do dispositivo, e camadas mais finas sofrem deformações durante a aplicação. - Remova o mofo do forno e deixe o dispositivo microfluídico esfriar até a temperatura ambiente. Depois de resfriado, remova cuidadosamente a porção desejada do PDMS com um bisturi.
NOTA: Fortes pressões sobre o mofo resultam em fraturas do mofo. Não toque no PDMS com as próprias mãos, pois as impressões digitais afetarão a transparência óptica. - Sele temporariamente a parte inferior do canal PDMS (onde a geometria desejada foi gravada) com fita. Com um perfurador de biópsia de 0,5 mm de diâmetro, perfure o canal microfluídico para criar uma entrada e uma saída que se encaixem no tubo de 0,5 mm (diâmetro interno).
NOTA: A natureza macia do PDMS garante a tensão assim que o tubo for inserido. Canais de entrada e saída não podem ser feitos depois que o PDMS foi selado ao vidro. - Sele o canal microfluídico por meio da ligação de plasma de oxigênio usando o gerador de alta frequência (plasma bonder, Tabela de Materiais). Para isso, limpe uma lâmina de vidro silicato (25 mm x 75 mm) com etanol e deixe secar. Remova a fita do canal PDMS e coloque o canal com o lado poroso voltado para cima. Trate as superfícies do vidro silicato e do PDMS com plasma por cerca de 45 s em temperatura ambiente.
- Coloque o canal PDMS sobre a lâmina de vidro silicato e aqueça a 100 °C por 30 minutos em uma placa elétrica.
- Remova o dispositivo microfluídico da placa quente e resfrie-o até a temperatura ambiente. Conecte a entrada do canal PDMS com tubos. Aplique um vácuo por 30 minutos para remover o ar do PDMS, que é quase impermeável a fluidos, mas permeável a gases.
- Prepare 100 mL de tampão de motilidade (10 mM fosfato de potássio, 0,1 mM de ácido etilenediaminatetraacético (EDTA), suplementado com 1% p/v de glicose, pH 7,0) e injete 1 mL dele no dispositivo microfluídico usando uma bomba de seringa operada a 10 μL min-1.
NOTA: Como o PDMS está subsaturado em gás (devido à etapa anterior de vácuo), as bolhas desaparecem em ~30 minutos.
3. Analisar o transporte bacteriano usando dispositivos microfluídicos PDMS
- Coloque o dispositivo microfluídico PDMS previamente saturado com o buffer de motilidade no estágio do microscópio. Use fita adesiva para fixar a tubulação e minimizar a perturbação do fluxo durante o movimento da etapa.
- Mova o estágio do microscópio para o canal de observação próximo à saída. Usando microscopia de campo claro ou contraste de fase, foque no centro do canal de observação e ajuste a ampliação para visualizar células bacterianas individuais.
- Altere as configurações do caminho da luz para microscopia de fluorescência e ajuste o tempo de exposição da câmera para identificar células bacterianas individuais (por exemplo, 100 ms), ou de modo que os sinais de fluorescência das células sejam pelo menos 3 vezes mais fortes que o ruído de fundo.
- Em seguida, insira o tubo de entrada em um tubo de 2 mL contendo a suspensão bacteriana. Inverta a direção da bomba e comece a retirar a suspensão com uma vazão de 1 μL min-1.
- Escaneie a seção transversal de todo o canal de observação, registrando uma imagem composta a cada 2 minutos, durante toda a duração do experimento.
