Transfecção de um sistema de expressão gênica induzível em células que expressam uma proteína efetora bacteriana

Resumo

Fonte: Berens, C. et al. Aplicação de um sistema de expressão induzível para estudar a interferência dos fatores de virulência bacteriana com a sinalização intracelular. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo demonstra o uso de um sistema de expressão induzível para identificar onde a proteína efetora bacteriana CaeB interrompe a cascata apoptótica do hospedeiro. Ele descreve as etapas para transfectar células que expressam CaeB com um sistema responsivo à tetraciclina, a fim de induzir a expressão gênica pro-apoptótica, a fim de identificar o ponto de interrupção dentro da cascata.

Protocolo

1. Transfecção da linha celular estável com o sistema de vetores de expressão induzível

1. Sementes células embrionárias humanas de rim (HEK)293 expressando estabilidade proteína fluorescente verde (GFP) ou GFP-CaeB em uma placa de 12 poços com densidade de 1 x^{10 5} células/poço.
2. 19 horas após a semeadura, co-transfecte as células com o plasmídeo regulador e o plasmídeo de resposta, codificando Bax ou caspase 3 ativada.
   1. Co-transfecte as células estáveis HEK293 com 100 ng de plasmídeo regulador pWHE125-P (Figura 1) e 100 ng dos plasmídeos de resposta pWHE655-hBax ou pWHE655-revCasp3 (Figura 2) e 0,4 μl de polietilinimina.
   2. Prepare o ácido desoxirribonucleico (DNA) e o reagente de transfecção de polietilenimina em 75 μl de meio Opti-MEM e incube por exatamente 5 minutos em temperatura ambiente (RT). Para formação complexa, incube ambas as misturas juntas por 15 minutos em RT.
3. Adicione a solução de polietilenimina/DNA em gota às células e incube a 37 °C com 5% de_CO2.

2. Indução da Apoptose

1. 5 horas após a transfecção, induzir a expressão das proteínas pró-apoptóticas pela adição de 1 μg/ml de doxiciclina ao meio de cultivo. Incube células por 18 horas a 37 °C com 5% de_CO2.

Resultados

Figura 1. Visão geral esquemática do plasmídeo regulador pWHE125. Elementos essenciais para a propagação em bactérias, incluindo a origem da replicação (ori pBR) e uma de resistência a antibióticos contra ampicilina (Amp^R), ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM	Tecnologias de vida	31966-021
FCS	Biochrom	S0115
Caneta/Estreptococo	Tecnologias de vida	15140-122
OptiMEM	Tecnologias de vida	51985
X-tremeGENE 9	Roche	6365752001
Polietilenimina	Polícias	23966
Doxiciclina	Sigma Aldrich	D9891