Monitoramento Contínuo do Ruído Biológico em Bactérias Usando Microscopia de Time-Lapse

Resumo

Fonte: Chaimovitz, E. A., et al. Medição contínua de ruído biológico em Escherichia coli usando microscopia time-lapse. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a visualização em tempo real do ruído biológico em E. coli ao acompanhar flutuações na fluorescência da GFP durante o crescimento e divisão bacteriana usando microscopia de time-lapse.

Protocolo

1. Preparando a amostra para microscopia de imagem
   1. Retire o frasco do banho-maria. Limpe o lado de fora do frasco e deixe esfriar até a temperatura ambiente (25 °C).
      NOTA: Remova o frasco cerca de 3 minutos antes do tempo acabar.
   2. Despeje 3 mL do gel constantemente no perímetro da placa em movimento circular. Deixe solidificar por alguns minutos.
   3. Fele as placas com fita e perfure vários furos com agulha de 25 G. Vire todas as panelas para evitar que a condensação de água escorra sobre o gel.
   4. Incube todos os pratos a 4 °C por 30 minutos para permitir a solidificação completa e evitar a mitose celular.
      NOTA: Deixe as amostras a 4 °C para medições sucessivas, no máximo um dia.
   5. Ligue o microscópio conforme as instruções do fabricante.
   6. Encontre o foco inicial usando a lente de menor amplificação e ative o sistema de foco automático (AFS).
   7. Use óleo se necessário, afogue a lente com óleo e espalhe cuidadosamente movendo a placa com um controlador de plataforma (não manualmente), e o AFS pode ser ativado novamente.
   8. Use a seção transversal relativa na direção Z, seguindo a sugestão padrão para seções transversais em Z passos.
      NOTA: Tire imagens em campo claro a cada 5 minutos e imagens fluorescentes a cada 20 minutos. Às vezes, o foco precisa ser ajustado nos primeiros 30 minutos. Pré-aquecer a caixa do incubador do microscópio e o óleo, enquanto refrigera a amostra, tende a ajudar a reduzir a perda inicial de foco.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Recipiente de vidro 35mm	Mattek	P35G-0.170-14-C	Espessura correspondente à lente do microscópio.
Agarose	Lonza	5004	Preparação LB
Eclipse Ti	Nikon		Microscópio invertido
Immersol 518F	Zeiss	4449600000000	Óleo de imersão
Fita parafilme	Bemis	PM-996	Referido como fita em texto