Detecção da expressão de enzimas-alvo em células bacterianas geneticamente modificadas

Resumo

Fonte: Kim, H. et. al., Triagem Multienzimática Usando um Sistema de Triagem Enzimática Genética de Alto Rendimento. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra um método de triagem genética para detectar a expressão enzimática usando bibliotecas metagenômicas de fosmid e substratos cromogênicos. A citometria de fluxo identifica e isola células individuais produzindo produtos coloridos, permitindo a seleção de alta produtividade das células ativas que expressam enzimas.

Protocolo

1. Preparando a Biblioteca Metagenômica com um sistema de triagem enzimática genética para a detecção de p-nitrofenol (pNP) (pNP-GESS)
   1. Construa uma biblioteca metagenômica em Escherichia coli com um vetor fosmid usando um kit de produção de biblioteca fosmid.
   2. Aliquota 100 μl da biblioteca para armazenamento a −70 °C, que é uma fonte de células metagenômicas da biblioteca.
      NOTA: A densidade óptica de uma amostra medida em um comprimento de onda de 600 nm (OD₆₀₀) desse estoque de biblioteca é aproximadamente 100.
   3. Descongelar 100 μl da biblioteca metagenômica original em gelo e inocular em um frasco de 500 ml contendo 50 ml de Luria-Bertani (LB) e 12,5 μg/ml cloranfenicol, seguido por incubação a 37 °C por 2 horas.
   4. Colhe as células em um tubo cônico de 50 ml por centrifugação a 1.000 x g por 20 min a 4 °C.
   5. Resuspenda rapidamente o pellet em 50 ml de água destilada gelada (DW) e centrifuge a 1.000 x g por 20 min a 4 °C novamente.
   6. Ressuspenda o pellet em 50 μl de DW gelado com 10% (v/v) de glicerol. Use 50 μl dessa alíquota da célula para eletroporação.
   7. Coloque a mistura de células eletrocompetentes de 50 μl e DNA pGESS(E135K) (100 ng) em uma cuveta eletroporação gelada e eletropore (1,8 kV/cm, 25 μF) a mistura.
   8. Adicione rapidamente 1 ml de caldo super ótimo com meio de repressão catabolica (SOC) e ressuspenda as células suavemente.
   9. Transfira as células para um tubo de fundo arredondado de 14 ml usando uma pipeta e incube a 37 °C por 1 hora.
   10. Espalhe 500 μl das células recuperadas em uma placa LB de 20 x 20 cm quadrados contendo 12,5 μg/ml de cloranfenicol e 50 μg/ml de ampicilina. Incube a placa a 30 °C por 12 horas.
   11. Raspe as colônias usando um raspador de células e colete as células em um tubo cônico de 50 ml usando um meio de armazenamento celular gelado.
   12. Centrifuge a 1.000 x g por 20 min a 4 °C. Resuspenda o pellet em 10 ml de meio de armazenamento gelado para atingir um OD₆₀₀ de 100.
   13. Aliquota 20 μl das células para armazenamento a −70 °C.
        
2. Remoção de Falsos Positivos da Biblioteca Metagenômica
   1. Descongele as células da biblioteca metagenômica padrão (do Passo 1.13) contendo DNA metagenômico fosmid e pGESS(E135K) sobre gelo.
   2. Inocule 10 μl das células em 2 ml LB contendo 50 μg/ml de ampicilina e 12,5 μg/ml de cloranfenicol em um tubo de fundo arredondado de 14 ml. Incube a 37 °C com tremores a 200 rpm por 4 horas.
   3. Enquanto isso, ligue a máquina de classificação de células ativada por fluorescência (FACS) e abra o software padrão FACS. Use as seguintes configurações: diâmetro da ponta do bico, 70 μm; Sensibilidade da Área de Dispersão Direta (FSC-A), amplificação V-logarítmica de 300; Sensibilidade da Área de Dispersão Lateral (SSC-A), amplificação V-logarítmica de 350; sensibilidade da área de isotiocianato de fluoresceína (FITC-A), amplificação 450 V-logarítmica; parâmetro de limiar, valor FSC-A 5.
      NOTA: Configurações típicas são fornecidas para dispositivos FACS mencionados na Tabela de Materiais. Ajuste as configurações para outros dispositivos FACS.
   4. Dilua as células da biblioteca metagenômica do Passo 2.2 adicionando 5 μl da amostra a um tubo de fundo arredondado de 5 ml contendo 1 ml de soro salino tamponado com fosfato (PBS).
   5. Coloque a amostra diluída da biblioteca na porta de carregamento do instrumento FACS e clique no botão Carregar no Painel de Aquisição do software FACS.
   6. Ajuste a taxa de eventos para 1.000 - 1.500 eventos/segundo clicando e controlando os botões de Taxa de Fluxo no painel.
   7. Crie diagrama de dispersão logarítmica FSC-A em escala logarítmica versus SSC-A em escala logarítmica em uma planilha global clicando no botão Dot Plot na barra de ferramentas. Ajuste a porta de dispersão R1 para abranger os eventos singlets (população bacteriana) usando o botão Polígono na barra de ferramentas.
   8. Plote um histograma com contagem de células versus FITC-A em escala logarítmica na folha clicando no botão Histograma. Depois, ajuste a tensão do FITC na aba de Configurações do Citometro na janela de Controle do Inspetor de modo que o pico da distribuição em forma de sino seja menor que 10² do FITC-A.
   9. Crie um FSC-A em escala logarítmica vs. o log plota do FITC-A clicando no botão Dot Plot na planilha global. Defina um portão de ordenação R2 no gráfico usando o botão Polígono na barra de ferramentas, de modo que o portão fique entre +5% e -5% células do centro da distribuição (um total de 10% de células ao redor do pico da curva em forma de sino).
   10. Coloque um tubo de coleta contendo 1,2 ml LB contendo 50 μg/ml de ampicilina e 12,5 μg/ml de cloranfenicol na saída do instrumento FACS e separe 10⁶ células que satisfazem tanto as portas R1 quanto R2.
   11. Remova o tubo de coleta, a tampa e o vórtice suavemente.
        
3. Rastreamento de Enzimas Metagenômicas
   1. Incube as células separadas (do Passo 2.11) a 37 °C com agitação a 200 rpm até que o OD₆₀₀ atinja 0,5.
   2. Adicione 1 μl de solução de indução de cópia para amplificar o número de cópias intracelulares de fosmid. Incube as células por mais 3 horas a 37 °C com agitação a 250 rpm.
   3. Para preparar as células para a separação, adicione 0,5 ml das células cultivadas e um substrato apropriado (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-celulosídeo ou fenil fosfato) em um tubo de fundo arredondado de 14 ml a uma concentração final de 100 μM.
      1. Para uma amostra controle, adicione 0,5 ml das células cultivadas do Passo 3.2 em um tubo de fundo arredondado de 14 ml. Adicione o mesmo volume de PBS que o volume do substrato no Passo 3.3.
   4. Incube as duas amostras a 37 °C com agitação a 200 rpm por 3 horas.
   5. Enquanto isso, prepare a máquina FACS com as mesmas configurações do Passo 2.3.
   6. Adicione 5 μl das células (para separação) e as células de controle a dois tubos de fundo arredondado de 5 ml contendo 1 ml PBS, respectivamente.
   7. Coloque o tubo contendo células de controle na porta de carregamento do FACS e clique no botão Carregar no Painel de Aquisição do software FACS. Ajuste a taxa de eventos para 1.000 - 3.000 eventos/segundo controlando os botões de Taxa de Fluxo no painel.
   8. Crie o gráfico de dispersão logarítrico FSC-A versus SSC-A em escala logarítmica clicando no botão Dot Plot na planilha global do software, e ajuste o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) usando o botão Polygon Gate na barra de ferramentas.
   9. Crie gráfico de dispersão FITC-A em escala logarítmica versus FITC-A em escala logarítmica clicando no botão Dot Plot na planilha de exercícios e defina um portão de ordenação R2 no gráfico usando o botão Polígono na barra de ferramentas, de modo que menos de 0,1% das células negativas sejam detectadas dentro do portão R2.
   10. Substitua o tubo de amostra de controle pelo tubo de amostra de triagem e ajuste a taxa de eventos para 1.000 - 3.000 eventos/seg controlando os botões de Taxa de Fluxo no painel.
   11. Coloque um tubo de coleta contendo 0,5 ml LB na saída do instrumento FACS e separe 10^{células 4} que satisfazem as portas R1 e R2.
       NOTA: O critério de classificação pode variar de 0,1% a 5% superior do FITC-A na porta R2. Nesse protocolo, o 1% superior das células foi coletado como positivo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
CopyControl	Epicentro	CCFOS110	Kit de produção da biblioteca Fosmid
Solução de indução CopyControl	Epicentro	CCIS125	Solução de indução por cópia de Fosmid
EPI300	Epicentro	EC300110	Célula eletrocompetente
pCC1FOS	Epicentro	CCFOS110	Vetor Fosmid
Pulsador genético Mxcell	Bio-Rad		Cuveta de eletroporação e sistema eletroporado
FACSAria III	Becton Dickinson		Citometria de Fluxo (máquina FACS)
AZ100M	Nikon		Microscópio
Ultraslim	Maestrogênio		Iluminador de LED
Tubo cônico de 50 ml	BD Falcon
Tubo de fundo arredondado de 14 ml	BD Falcon
Tubo de fundo arredondado de 5 ml	BD Falcon
P-nitrofenil fosfato	Sigma-Aldrich	N7653	Substrato
p-nitrofenil β-D-cellobiosídeo	Sigma-Aldrich	N5759	Substrato
P-nitrofenil butilato	Sigma-Aldrich	N9876	Substrato
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Triptona 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L, cloreto de sódio 10 g/L
Caldo super ótimo (SOB)	BD Difco	244310	Triptona 20 g/L, extrato de levedura 5 g/L, cloreto de sódio 0,5 g/L, sulfato de magnésio 2,4 g/L, cloreto de potássio 186 mg/L
Caldo super ótimo com repressão catabólica (SOC)		SOB, 0,4% de glicose
2x extrato de levedura triptona (2xYT)	BD Difco	244020	Digestão pancreática de caseína 16 g/L, extrato de levedura 10 g/L, extrato de levedura 5 g/L
Mídia de armazenamento celular			2x caldo YT, 15% de glicerol, 2% de glicose
pGESS(E135K)			Um vetor de DNA contendo dmpR, genes egfp com seus promotores apropriados, RBS e terminador. Veja a referência 5 no manuscrito para mais detalhes.
Cloranfenicol	Sigma	C0378
Ampicilina	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Software de Citometria de Fluxo Versão 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% fosfato dissódico, 0,024% fosfato monopotássico, pH 7,4