Detecção da expressão de enzimas-alvo em células bacterianas geneticamente modificadas

Abstract

Fonte: Kim, H. et. al., Triagem Multienzimática Usando um Sistema de Triagem Enzimática Genética de Alto Rendimento. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra um método de triagem genética para detectar a expressão enzimática usando bibliotecas metagenômicas de fosmid e substratos cromogênicos. A citometria de fluxo identifica e isola células individuais produzindo produtos coloridos, permitindo a seleção de alta produtividade das células ativas que expressam enzimas.

Protocol

1. Preparando a Biblioteca Metagenômica com um sistema de triagem enzimática genética para a detecção de p-nitrofenol (pNP) (pNP-GESS)
   1. Construa uma biblioteca metagenômica em Escherichia coli com um vetor fosmid usando um kit de produção de biblioteca fosmid.
   2. Aliquota 100 μl da biblioteca para armazenamento a −70 °C, que é uma fonte de células metagenômicas da biblioteca.
      NOTA: A densidade óptica de uma amostra medida em um comprimento de onda de 600 nm (OD₆₀₀) desse estoque de biblioteca é aproximadamente 100.
   3. Descongelar 100 μl da biblioteca metagenômica original em gelo e inocular em um frasco de 500 ml contendo 50 ml de Luria-Bertani (LB) e 12,5 μg/ml cloranfenicol, seguido por incubação a 37 °C por 2 horas.
   4. Colhe as células em um tubo cônico de 50 ml por centrifugação a 1.000 x g por 20 min a 4 °C.
   5. Resuspenda rapidamente o pellet em 50 ml de água destilada gelada (DW) e centrifuge a 1.000 x g por 20 min a 4 °C novamente.
   6. Ressuspenda o pellet em 50 μl de DW gelado com 10% (v/v) de glicerol. Use 50 μl dessa alíquota da célula para eletroporação.
   7. Coloque a mistura de células eletrocompetentes de 50 μl e DNA pGESS(E135K) (100 ng) em uma cuveta eletroporação gelada e eletropore (1,8 kV/cm, 25 μF) a mistura.
   8. Adicione rapidamente 1 ml de caldo super ótimo com meio de repressão catabolica (SOC) e ressuspenda as células suavemente.
   9. Transfira as células para um tubo de fundo arredondado de 14 ml usando uma pipeta e incube a 37 °C por 1 hora.
   10. Espalhe 500 μl das células recuperadas em uma placa LB de 20 x 20 cm quadrados contendo 12,5 μg/ml de cloranfenicol e 50 μg/ml de ampicilina. Incube a placa a 30 °C por 12 horas.
   11. Raspe as colônias usando um raspador de células e colete as células em um tubo cônico de 50 ml usando um meio de armazenamento celular gelado.
   12. Centrifuge a 1.000 x g por 20 min a 4 °C. Resuspenda o pellet em 10 ml de meio de armazenamento gelado para atingir um OD₆₀₀ de 100.
   13. Aliquota 20 μl das células para armazenamento a −70 °C.
        
2. Remoção de Falsos Positivos da Biblioteca Metagenômica
   1. Descongele as células da biblioteca metagenômica padrão (do Passo 1.13) contendo DNA metagenômico fosmid e pGESS(E135K) sobre gelo.
   2. Inocule 10 μl das células em 2 ml LB contendo 50 μg/ml de ampicilina e 12,5 μg/ml de cloranfenicol em um tubo de fundo arredondado de 14 ml. Incube a 37 °C com tremores a 200 rpm por 4 horas.
   3. Enquanto isso, ligue a máquina de classificação de células ativada por fluorescência (FACS) e abra o software padrão FACS. Use as seguintes configurações: diâmetro da ponta do bico, 70 μm; Sensibilidade da Área de Dispersão Direta (FSC-A), amplificação V-logarítmica de 300; Sensibilidade da Área de Dispersão Lateral (SSC-A), amplificação V-logarítmica de 350; sensibilidade da área de isotiocianato de fluoresceína (FITC-A), amplificação 450 V-logarítmica; parâmetro de limiar, valor FSC-A 5.
      NOTA: Configurações típicas são fornecidas para dispositivos FACS mencionados na Tabela de Materiais. Ajuste as configurações para outros dispositivos FACS.
   4. Dilua as células da biblioteca metagenômica do Passo 2.2 adicionando 5 μl da amostra a um tubo de fundo arredondado de 5 ml contendo 1 ml de soro salino tamponado com fosfato (PBS).
   5. Coloque a amostra diluída da biblioteca na porta de carregamento do instrumento FACS e clique no botão Carregar no Painel de Aquisição do software FACS.
   6. Ajuste a taxa de eventos para 1.000 - 1.500 eventos/segundo clicando e controlando os botões de Taxa de Fluxo no painel.
   7. Crie diagrama de dispersão logarítmica FSC-A em escala logarítmica versus SSC-A em escala logarítmica em uma planilha global clicando no botão Dot Plot na barra de ferramentas. Ajuste a porta de dispersão R1 para abranger os eventos singlets (população bacteriana) usando o botão Polígono na barra de ferramentas.
   8. Plote um histograma com contagem de células versus FITC-A em escala logarítmica na folha clicando no botão Histograma. Depois, ajuste a tensão do FITC na aba de Configurações do Citometro na janela de Controle do Inspetor de modo que o pico da distribuição em forma de sino seja menor que 10² do FITC-A.
   9. Crie um FSC-A em escala logarítmica vs. o log plota do FITC-A clicando no botão Dot Plot na planilha global. Defina um portão de ordenação R2 no gráfico usando o botão Polígono na barra de ferramentas, de modo que o portão fique entre +5% e -5% células do centro da distribuição (um total de 10% de células ao redor do pico da curva em forma de sino).
   10. Coloque um tubo de coleta contendo 1,2 ml LB contendo 50 μg/ml de ampicilina e 12,5 μg/ml de cloranfenicol na saída do instrumento FACS e separe 10⁶ células que satisfazem tanto as portas R1 quanto R2.
   11. Remova o tubo de coleta, a tampa e o vórtice suavemente.
        
3. Rastreamento de Enzimas Metagenômicas
   1. Incube as células separadas (do Passo 2.11) a 37 °C com agitação a 200 rpm até que o OD₆₀₀ atinja 0,5.
   2. Adicione 1 μl de solução de indução de cópia para amplificar o número de cópias intracelulares de fosmid. Incube as células por mais 3 horas a 37 °C com agitação a 250 rpm.
   3. Para preparar as células para a separação, adicione 0,5 ml das células cultivadas e um substrato apropriado (p-nitrofenil acetato, p-nitrofenil-β-D-celulosídeo ou fenil fosfato) em um tubo de fundo arredondado de 14 ml a uma concentração final de 100 μM.
      1. Para uma amostra controle, adicione 0,5 ml das células cultivadas do Passo 3.2 em um tubo de fundo arredondado de 14 ml. Adicione o mesmo volume de PBS que o volume do substrato no Passo 3.3.
   4. Incube as duas amostras a 37 °C com agitação a 200 rpm por 3 horas.
   5. Enquanto isso, prepare a máquina FACS com as mesmas configurações do Passo 2.3.
   6. Adicione 5 μl das células (para separação) e as células de controle a dois tubos de fundo arredondado de 5 ml contendo 1 ml PBS, respectivamente.
   7. Coloque o tubo contendo células de controle na porta de carregamento do FACS e clique no botão Carregar no Painel de Aquisição do software FACS. Ajuste a taxa de eventos para 1.000 - 3.000 eventos/segundo controlando os botões de Taxa de Fluxo no painel.
   8. Crie o gráfico de dispersão logarítrico FSC-A versus SSC-A em escala logarítmica clicando no botão Dot Plot na planilha global do software, e ajuste o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) usando o botão Polygon Gate na barra de ferramentas.
   9. Crie gráfico de dispersão FITC-A em escala logarítmica versus FITC-A em escala logarítmica clicando no botão Dot Plot na planilha de exercícios e defina um portão de ordenação R2 no gráfico usando o botão Polígono na barra de ferramentas, de modo que menos de 0,1% das células negativas sejam detectadas dentro do portão R2.
   10. Substitua o tubo de amostra de controle pelo tubo de amostra de triagem e ajuste a taxa de eventos para 1.000 - 3.000 eventos/seg controlando os botões de Taxa de Fluxo no painel.
   11. Coloque um tubo de coleta contendo 0,5 ml LB na saída do instrumento FACS e separe 10^{células 4} que satisfazem as portas R1 e R2.
       NOTA: O critério de classificação pode variar de 0,1% a 5% superior do FITC-A na porta R2. Nesse protocolo, o 1% superior das células foi coletado como positivo.

Materials