In vitro Modelo de Cultura em Lote para Imitar a Fermentação Cólica pela Microbiota Intestinal Humana

Resumo

Fonte: Ahmadi, S., et al. Um modelo de cultivo lotado in vitro para estimar os efeitos dos regimes intervencionistas na microbiota fecal humana. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra um método para modelar a fermentação microbiana intestinal incubando amostras fecais com fibra fermentável dietética sob condições anaeróbias para estudar a produção de metabólitos pela microbiota intestinal.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo coleta de amostras foram realizados de acordo com as diretrizes do IRB do instituto.

CUIDADO: Consulte as Fichas de Dados de Segurança de Materiais apropriadas e siga as instruções e diretrizes para o treinamento adequado de Biossegurança Nível 2 (BSL-2). Siga todas as etapas de cultivo conforme as regras padrão de biossegurança e utilize um gabinete BSL-2 usando condições assépticas. Além disso, amostras fecais de diferentes modelos e sujeitos humanos podem apresentar um risco potencial de disseminação de doenças transmitidas por microbianos. Procure imediatamente ajuda médica em caso de qualquer lesão ou infecção. Além disso, o uso de amostras de fezes humanas e animais deve ser aprovado por comitês éticos institucionais e deve estar em conformidade com protocolos para uso de amostras e informações do sujeito.

1. Preparação de Mídia Cultural

1. Preparação do meio de cultura, prepare nove tipos de soluções de estoque:
   1. Solução A (1.000 mL): Dissolva 5,4 g de cloreto de sódio (NaCl), 2,7 g de dihidrogénio fosfato de potássio (KH₂PO₄), 0,16 g de dihidrato de cloreto de cálcio (CaCl_{2.2H 2}O), 0,12 g de cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl_{2.6H 2}O), 0,06 g de tetrahidratado de cloreto de manganês (MnCl_{2.4H 2}O), 0,06 g de cloreto cobaltoso hexahidratado (CoCl_{2.6H 2}O) e 5,4 g de sulfato de amônio (NH₄)2SO₄, em água desionizada, para elevar o volume total a 1.000 mL.
   2. Solução B (1.000 mL): Dissolva 2,7 g de Fosfato de Hidrogênio de Potássio (K_{2HPO 4}) em água desionizada para atingir o volume total de 1000 mL.
   3. Solução de minerais traço (1.000 mL): Dissolva 500 mg de etilenediamina-tetraacetato dissódico (Na₂EDTA), 200 mg de heptahidratado sulfato ferroso (FeSO 4,7H₂O), 10 mg de sulfato de zinco heptahidratado (ZnSO_{4,7H 2}O), 3 mg de tetrahidratado de cloreto de manganês(II) (MnCl_{2,4H 2}O), 30 mg de ácido fosfórico (H₃PO₄), 20 mg de CoCl 2,6H ₂O, 1 mg de dihidrato de cloreto pútrico (CuCl 2,2H₂O), 2 mg de cloreto de níquel (II) hexahidratado (NiCl_{2,6H 2}O) e 3 mg de molibdato de sódio diidratado (Na₂MoO_{4,2H 2}O) em água desionizada para atingir o volume total de 1.000 mL.
      NOTA: Essa solução é sensível à luz, portanto, certifique-se de ser armazenada em tubos/frascos escuros/pretos ou enrolados em alumínio.
   4. Solução vitamínica solúvel em água (1.000 mL): Dissolva 100 mg de tiamina cloridrato (Tiamina-HCl), 100 mg de ácido D-pantotenico, 100 mg de niacina, 100 mg de piridoxina, 5 mg de ácido P-aminobenzoico e 0,25 mg de vitamina B12 em água desionizada para obter um volume total de 1.000 mL.
   5. Folato: solução de biotina (1.000 mL): Dissolva 10 mg de ácido fólico, 2 mg de D-biotina e 100 mg de bicarbonato de amônio (NH_{4HCO 3}) em água desionizada para obter um volume total de 1.000 mL.
   6. Solução de riboflavina (1.000 mL): Dissolva 10 mg de riboflavina em 5 mM de solução HEPES (4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico) (1,19 g/L) para obter um volume total de 1.000 mL.
   7. Solução de hemin (10 mL): Dissolva 5.000 mg de hemin em 10 mM de solução de hidróxido de sódio (NaOH) (0,4 g/L) para atingir o volume total de 10 mL.
   8. Mistura de ácidos graxos de cadeia curta (10 mL): Combine 2,5 mL de N-valerato, 2,5 mL de isovalato, 2,5 mL de isobutirato e 2,5 mL: DL-α-metilbutirato.
      NOTA: Essa solução é recomendada para usar em uma exaustão de fumo para evitar cheiro e fumaça.
   9. Resazurina (1.000 mL): Dissolva 1 g de resazurina em água desionizada e faça o volume total chegar a 1.000 mL.
2. Meio utilizado para fermentação anaeróbica in vitro
   1. Para preparar esse meio, misture 330 mL da Solução A, 330 mL da Solução B, 10 mL de solução de minerais traço, 20 mL de solução vitamínica hidrosolúvel, 5 mL de folato: solução de biotina, 5 mL de solução de riboflavina; 2,5 mL de solução de hemina, 0,4 mL de mistura de ácidos graxos de cadeia curta, 1 mL de Resazurina, 0,5 g de extrato de levedura, 4 g de carbonato de sódio (Na₂CO₃), 0,5 g de cisteína HCl-H₂O e 0,5 g de tripticase, adicionando 296,1 mL de água destilada.
   2. Verifique o pH e certifique-se de que está em torno de 7,0; se não, ajuste o pH com 1 N HCl ou 1 N NaOH. Esterilize filtrando a vácuo o meio usando um filtro de garrafa sob a estação de trabalho asséptica.
   3. Alternativamente, misture todos os componentes (exceto vitaminas e soluções de hemin) e o autoclave a 121 °C por 20 minutos e deixe esfriar até a temperatura ambiente. Simultaneamente, filtre-esterilize as soluções vitamínicas e heminas usando filtros de membrana de 0,22 μm e adicione-as ao meio autoclavado e resfriado antes de dispensar.

2. Preparação da Câmara Anaeróbica e Materiais Necessários

1. Mantenha todos os materiais, soluções e ferramentas necessárias para o experimento de fermentação dentro da câmara anaeróbica pelo menos 48 horas antes do início do experimento, para garantir que qualquer oxigênio residual associado às ferramentas e oxigênio solúvel em tampões/soluções seja removido e todos os materiais sejam aclimatados às condições anaeróbias estabelecidas.
   NOTA: Materiais necessários dentro da câmara anaeróbica (48 horas antes do início do experimento): (i) meio de fermentação; (ii) solução anaeróbica (preparada conforme a seção 4.1), (iii) vortexer, (iv) balança de pesagem, (v) toalhas de musselina (vi) tesouras, (vii) funil, (viii) tubos de 1,5, 2,0, 15, 50 mL, (ix) pipetador (2, 20, 200 e 1.000 μL) e pontas de pipeta compatíveis, (x) pieta de pistola e carapetas (5 e 10 mL), (xi) lenços de papel, (xii) marcadores, (xiii) tubos para diferentes tubos, (xiv) caixa de resíduos, (xv) indicador de O2 e (xvi) borrifador de etanol 70% (desinfetante).

3. Preparação de Tubos e Fibras

1. Pesar 300 mg de inulina e transferir para um tubo de 50 mL, seguido pela adição asséptica de 26 mL de meio fermentativo já preparado e armazenado na câmara anaeróbia. Prepare um tubo em branco para cada tipo de amostra fecal e para cada tubo experimental (de acordo com o número de compostos testados), em triplicado.
2. Deixe esses tubos dentro da câmara anaeróbica por cerca de 24 horas para permitir a hidratação das amostras antes de iniciar o experimento de fermentação. Certifique-se de que a temperatura do tubo esteja em 37 °C no momento da inoculação, portanto, coloque os tubos na incubadora dentro da câmara anaeróbia.

4. Preparação do Inóculo

1. Solução anaeróbica de diluição (pelo menos 48 h antes do experimento de fermentação): Dissolva 5 g de NaCl, 2 g de glicose e 0,3 g de Cisteína-HCl em água desionizada e alcance o volume total para 1.000 mL. Autoclave e armazene-o dentro da câmara anaeróbica por pelo menos 48 horas antes do uso.
2. Preparação do inoculo fecal (no dia do experimento de fermentação): Pesar 5 g de amostra fresca de fezes em um tubo cônico de 50 mL, adicionar solução anaeróbica de diluição para um volume final de 50 mL (1:10 w/v) e usar o vórtice por 15 minutos ou até estar completamente homogeneizada. Filtre a mistura homogeneizada através de 4 camadas de pano de queijo estéril (autoclaved) e use-o imediatamente para inoculação nos tubos que contêm a mídia.
   NOTA: As amostras fecais de um grupo de participantes podem ser agrupadas se o objetivo experimental for comparar o efeito de um determinado composto/ingrediente sobre a microbiota fecal geral saudável versus a doente em geral.

5. Fermentação e Amostragem

1. Prepare os tubos de acordo com a seção 4.2 e inocule tubos em branco/controle e experimental com 4 mL de inoculo fecal diluído e filtrado. Incube os tubos inoculados a 37 °C dentro da câmara anaeróbia. Agite os tubos uma vez a cada hora, invertendo suavemente para ressuspender as fibras e o inóculo.
2. Colete amostras com a frequência necessária, por exemplo, a cada hora até 0, 3, 6, 9 e 24 horas durante a fermentação, retirando uma amostra de 2 mL de alíquota em um tubo de 2 mL a partir dos respectivos tubos de fermentação.
3. Meça o pH das alíquotas usando um medidor de pH de laboratório (inserindo diretamente o eletrodo de pH na amostra); centrifugar a amostra restante a 14.000 x g por 10 minutos a 4 °C. Congelar imediatamente o sobrenadante e o pellet em nitrogênio líquido e, após o congelamento rápido, armazenar o sobrenadante para análise de SCFAs (ácidos graxos de cadeia curta) e pellet para análise do microbioma a -80 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Bicarbonato de amônio	Sigma-Aldrich	217255
Sulfato de amônio	TGI	C2388	Tóxico
Diidratado de cloreto de cálcio	Sigma-Aldrich	C3306	Irritante
Cloreto cobaltoso hexahidratado	Sigma-Aldrich	255599
Diidrato de cloreto cúprico	Acros orgânicos	2063450000	Tóxico, Irritante
Cisteína-HCl	Sigma-Aldrich	C121800
D-biotina	Sigma-Aldrich	B4501
Ácido D-Pantotênico	Alfa Aesar	A16609
Diidrato diidrato de etilendediamina, tetraacetato	Biorad	1610729
DL-α-metilbutirato	Sigma-Aldrich	W271918
Sulfato ferroso heptahidratado	Sigma-Aldrich	F8263	Tóxico
Ácido fólico	Alfa Aesar	J62937
Glicose	Sigma-Aldrich	G8270
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039
Hepes	Alfa Aesar	A14777
Isobutirato	Alfa Aesar	L04038
Isovalerato	Alfa Aesar	A18642
Cloreto de magnésio hexahidratado	Sigma-Aldrich	M8266
Manganês cloreto tetrahidratado	Sigma-Aldrich	221279
Niacina (ácido nicotínico)	Sigma-Aldrich	N4126
Cloreto de níquel(II) hexahidrato	Alfa Aesar	A14366	Tóxico
N-valerato	Sigma-Aldrich	240370
Ácido P-aminobenzoico	MP China	102569	Tóxico, Irritante
Ácido fosfórico	Sigma-Aldrich	P5811
Dihidrofosfato de potássio	Sigma-Aldrich	P5504
Fosfato de hidrogênio de potássio	Sigma-Aldrich	1551128
Piridoxina	Alfa Aesar	A12041
Resazurin	Sigma-Aldrich	R7017
Riboflavina	Alfa Aesar	A11764
Carbonato de sódio	Sigma-Aldrich	1613757
Cloreto de sódio	Biorreagentes Fisher	7647-14-5
Hidróxido de sódio	Fisher Chemicals	S320
Molibdato de sódio diidratado	Acros orgânicos	206375000
Cloridrato de tiamina	Acros orgânicos	148991000
Tripticase	BD em Biociências	211921
Vitamina B12	Sigma-Aldrich	V2876
Extrato de levedura	Sigma-Aldrich	70161
Sulfato de zinco heptahidratado	Sigma-Aldrich	Z0251
Filtro de membrana de 0,22 μm
Esferas magnéticas de purificação AMPure	Agencourt
Câmara anaeróbica com incubador	Sistema anaeróbico forma, Thermo Scientific, EUA
Filtro de garrafa	Corning
Gaze
Medidor de pH
Vórtice	Termociência