Fermentação microaeróbica do hidrolisado de bambu por Klebsiella pneumoniae

Resumo

Fonte: Wei, D., et al., Produção de Produtos Químicos por Klebsiella pneumoniae Usando Hidrolisado de Bambu como matéria-prima. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra a conversão microbiana de açúcares derivados do bambu em 2,3-butanediol por meio do cultivo de Klebsiella pneumoniae em um meio à base de hidrolisado sob condições microaeróbicas e levemente ácidas.

Protocolo

1. 2,3-Butanediol Produção pelo Wildtype K. pneumoniae

1. Use 3 L de hidrolisado de bambu como solvente para a preparação do meio.
2. Prepare um meio de fermentação contendo 4 g/L de licor de milho em infusão, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 6 g/L K_{2HPO 4}, 3 g/L_{KH 2}PO₄ e 0,2 g/L_{MgSO 4}. Ajuste o pH do meio para neutro usando 2,5 M de NaOH. Use um biorreator de 5 L contendo 3 L de meio de fermentação autoclavado para fermentação.
3. Use células de K. pneumoniae armazenadas em uma geladeira de baixa temperatura a -80°C.
4. Para a cultura de sementes, incube um frasco de 250 mL contendo 50 mL de meio Luria-Bertani (LB) durante a noite a 37 °C, com agitação a 200 rpm. Use médio LB contendo 10 g/L de triptona, 5 g/L de extrato de levedura e 10 g/L de NaCl. NOTA: A densidade celular da cultura de sementes deve atingir OD 2 (densidade óptica a 600 nm).
5. Inocule um frasco de 50 mL da cultura de sementes no biorreator. Mantenha a cultura em pH 6,0 e 37 °C. Use uma taxa de suplementação de ar de 2 L/min e uma taxa de agitação de 250 rpm, criando uma condição microaeróbica.
6. Colete amostras de 5 mL a cada 2 horas durante a fermentação e analise-as com cromatografia líquida de alta pressão para determinar as concentrações químicas no caldo.
7. Monitore o álcali adicionado ao biorreator online usando sistemas de célula de combustível microbiana/aquisição de dados ou MFCS/DA.
   NOTA: Ácidos orgânicos são produzidos no processo de fermentação, e NaOH é adicionado para manter o pH da cultura estável. O volume de álcali adicionado representa a quantidade de ácido produzida. Quando a linha adicionada a álcalis se estabiliza, o processo é concluído, seja por exaustão da fonte de carbono ou morte celular.

2. Produção de R-acetoína pelo mutante budC de K. pneumoniae

1. Prepare um meio para produção de acetoína contendo 4 g/L de licor de milho para infusão, 2 g/L (NH₄)₂SO₄, 3 g/L de acetato de sódio, 0,4 g/L de KCl e 0,1 g/L de_{MgSO 4}.
2. Use K. pneumoniae-ΔbudC para a produção de R-acetoína. Repita os passos 1.4-1.5.
   NOTA: o budC codifica 2,3-butanediol desidrogenase. K. pneumoniae-ΔbudC perde a atividade desidrogenase 2,3-butanediol e produz R-acetoína em vez de 2,3-butanediol.
3. Mantenha a cultura em pH 6,0 e 37 °C. Use uma taxa de suplementação de ar de 4 L/min e uma taxa de agitação de 450 rpm, uma condição aeróbica.
   NOTA: A suplementação de oxigênio é maior do que a produção de 2,3-butanediol.
4. Analise as amostras conforme no passo 1.6.

3. Produção de Ácido 2-Cetoglucânico pelo mutante budA de K. pneumoniae

1. Para a produção de ácido 2-cetogluconico, use o mesmo meio que para a produção de R-acetoína.
2. Use K. pneumoniae-ΔbudA para produção de ácido 2-cetogluconico. Repita os passos 1.4-1.5.
   NOTA: budA codifica α-acetolactato descarboxilase. K. pneumoniae-ΔbudA perde a atividade de α-acetolactato descarboxilase e produz ácido 2-cetoglucônico, usando glicose como substrato.
   NOTA: A síntese de ácido 2-cetoglucânico é um processo dependente da condição ácida. Foi desenvolvida uma fermentação em dois estágios para a produção de ácido 2-cetoglucrônico; No primeiro estágio, a cultura de sementes é inoculada no biorreator.
3. Mantenha a cultura em pH 7,0 e 37 °C. Use uma taxa de suplementação com ar de 4 L/min e uma taxa de agitação de 500 rpm.
   NOTA: Nessas condições, as células crescem muito rápido (a densidade celular atinge OD 7 em cerca de 4 horas). Depois, a fermentação progride para a segunda etapa, durante a qual o pH da cultura diminui para 5,0. Nenhum ácido é adicionado; os ácidos orgânicos produzidos na cultura naturalmente levam à diminuição do pH. Nessas condições ácidas, o crescimento celular para, mas o ácido 2-cetoglucônico é sintetizado e se acumula no caldo.
4. Analise as amostras conforme no passo 1.6. Usando o hidrolisado do bambu como fonte de carbono.
   NOTA: A glicose no meio é convertida em ácido 2-cetoglucônico, e a xilose é convertida em ácido xilônico. Assim, obtém-se uma mistura de ácido 2-cetoglucônico e ácido xilônico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Autoclave	SANYO	3780
Biorreator	Sartorius Stedim Biotecnologia	Bostat Aplus
Agitador	IKA	RW 20
Sistema de cromatógrafo líquido de alto desempenho	Shimadzu Corp	20AVP
Pó de bambu	Comprado da Província de Zhejiang, China		Número de malha, 50
Celulase	Youtell Biochemical, Shandong, China		200 PFU/mL