Uma abordagem baseada em Cromatografia Líquida e Espectrometria de Massas para Análise de Metabólitos de S. aureus

Resumo

Fonte: Samuels, D. J., et al. Uma abordagem baseada em cromatografia líquida tandem – espectrometria de massas para análise de metabólitos de Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o uso da cromatografia líquida–espectrometria de massa para identificar e quantificar metabólitos intracelulares de S. aureus. Ele descreve as etapas envolvidas na extração de metabólitos, normalização de peptídeos, cromatografia líquida e análise espectrométrica de massas.

Protocolo

1. Extração de Metabólitos

1. Descongelam amostras em gelo úmido e desregulam as células em um homogeneizador com quatro rajadas de 30 s a 6.000 rpm, com períodos de resfriamento de 2 minutos sobre gelo seco entre os ciclos.
2. Clarifique os lisados por 15 minutos em uma microcentrífuga pré-refrigerada e refrigerada na velocidade máxima (ou seja, 18.213 x g a ≤4 °C).
3. Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo.
4. Usando uma micropipeta, transfira uma pequena porção da amostra para um tubo de microcentrífuga para quantificar o conteúdo residual de peptídeos na etapa 2; armazene o restante a -80 °C.
   NOTA:

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Material/Equipamentos
Tubos resistentes a impactos, 2 mL	USA Scientific	1420-9600
Contas de sílice, 0,1 mm	Biospec Products Inc	11079101Z
Homogeneizador Precellys 24	Bertin Instruments	EQ03119-200-RD000.0
Kit de Ensaio de Proteína Micro BCA	Pierce (Termociência)	23235
Coluna hidreto de diamante Cogent tipo C	Agilent	70000-15P-2
Tempo de Voo com Massa Precisa (TOF) LC-MS, Série 6200	Agilent	G6230B
Quat Pump, Série 1290	Agilent	G4204A
Bomba de Lixo, Série 1290	Agilent	G4220A
Acionamento de válvulas, Série 1290	Agilent	G1107A
Bomba Isocrática, Série 1290	Agilent	G1310B
TCC, Série 1290	Agilent	G1316C
Sampler, Série 1290	Agilent	G4226A
Termostato, Série 1290	Agilent	G1330B
Químico
Soro salino tamponado com fosfato (pH 7,4) 10x	Ambion	AM9624	Dilua fresco a 1x com água ultrapura
Acetonitrilo	Fisher Scientific	A955-500	Optima LC-MS
Ácido fórmico	Sigma Aldrich	94318	Para espectrometria de massa, 98%
MassHunter	Agilent	G3337AA
Cepa bacteriana	Espécie	Coar	Genótipo
SRB 337	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	Tipo Selvagem
SRB 372	Staphylococcus aureus	USA200 MSSA UAMS-1	ΔcodY::erm