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1. Extração de Metabólitos
- Descongelam amostras em gelo úmido e desregulam as células em um homogeneizador com quatro rajadas de 30 s a 6.000 rpm, com períodos de resfriamento de 2 minutos sobre gelo seco entre os ciclos.
- Clarifique os lisados por 15 minutos em uma microcentrífuga pré-refrigerada e refrigerada na velocidade máxima (ou seja, 18.213 x g a ≤4 °C).
- Transfira o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo.
- Usando uma micropipeta, transfira uma pequena porção da amostra para um tubo de microcentrífuga para quantificar o conteúdo residual de peptídeos na etapa 2; armazene o restante a -80 °C.
NOTA: O volume da amostra reservada varia, dependendo do ensaio de ácido bicincônínico (BCA) usado na etapa 2.1. Esta amostra deve ser armazenada em gelo úmido para análise imediata ou congelada a -80 °C.
2. Ensaio de Ácido Bicinquinínico (BCA)
- Realize um ensaio de BCA conforme recomendado pelo fabricante do kit, usando amostras da etapa 1.4 para determinar a concentração residual de peptídeos para cada amostra.
3. Cromatografia Líquida-Espectrometria de Massa (LC-MS)
- Misture 75 μL de extrato de Staphylococcus aureus (S. aureus) com 75 μL do solvente LC-MS B, preparado na etapa 1.4.
- Vórtice para misturar e girar a 13.000 x g por 5 minutos.
- Coloque 100 μL de sobrenadante em um frasco de cromatografia líquida (LC) e o tape. Certifique-se de que nenhuma bolha de ar fique presa na amostra.
- Carregue os frascos LC no autosampler LC-MS e edite a lista em execução no software "Offline Worklist Editor".
- Preencha as colunas "Nome da Amostra" (por exemplo, tipo selvagem-1), "Posição da Amostra" (ex.: P1-A1), "Método" (por exemplo, Método Ácido Fórmico-Negativo) e "Arquivo de Dados" (por exemplo, tipo selvagem 1). Clique no botão "Salvar a Lista de Trabalhos". Abra o software "Mass Spectrometry Data Acquisition Workstation" e insira a lista de trabalho previamente salva. Clique no botão "Iniciar Execução da Lista de Trabalhos" para iniciar a medição contínua do LC-MS.
- Separe as amostras em uma coluna, vincule a coluna a um espectrômetro de tempo de voo (TOF) e acople o espectrômetro TOF ao sistema LC. Use um gradiente de fase móvel da seguinte forma: 0-2 min, 85% solvente B; 3-5 min, 80% solvente B; 6-7 min, 75% solvente B; 8-9 min, 70% solvente B; 10-11,1 min, solvente B a 50%; 11,1-14 min, 20% solvente B; e 14,1-24 min, 5% solvente B; terminando com um período de reequilíbrio de 10 minutos a 85% de solvente B e uma vazão de 0,4 mL min-1.
- Usando uma bomba isocrática, infunde uma solução de massa de referência na passagem para permitir a calibração simultânea dos eixos de massa.
NOTA: Essa etapa é baseada no manual padrão do espectrômetro TOF.- Use a mistura de ácido acético D4 e fosfazina hexakis (1H,1H,3H-tetrafluoropropoxi) como solução de massa de referência para realizar a calibração em tempo real. Use a bomba isocrática com vazão de 2,5 mL min-1 para a infusão.
4. Correção em lote da contagem de íons
- Designe qualquer amostra para servir como amostra de referência para correção em lote (por exemplo, wild-type, replicar 1).
- Calcule a soma das contagens de íons para todos os metabólitos dentro da amostra de referência. Repita esse cálculo para todas as amostras.
- Divida a contagem total de íons de cada amostra pela contagem total de íons da amostra de referência para gerar uma razão.
- Divida a contagem de íons de cada metabólito dentro de uma amostra pela razão amostra/referência para obter uma contagem de íons corrigida por lote para cada metabólito.
5. Normalização de peptídeos
- Divida os valores de contagem de íons corrigidos por lote para cada amostra obtida na etapa 4 pela concentração do peptídeo determinada com o ensaio BCA na etapa 2 para obter um valor normalizado para cada metabólito.
NOTA: As contagens de íons normalizadas, corrigidas por lote, para cada metabólito obtido no passo 5.1 podem ser comparadas diretamente entre cepas e submetidas a análise estatística (por exemplo, um teste U de Mann-Whitney). Alternativamente, um metabólito conhecido por não ser alterado, seja pelo tratamento ou pelo contexto genético, pode ser usado como normalizador para detectar alterações devido à decomposição do metabólito. A inclusão de uma quantidade conhecida de L-norvalina ou ácido glutárico no tampão de extração pode ser usada para corrigir a perda durante o processamento da amostra.