Monitorando o Crescimento Bacteriano em Diferentes Formulações de Meios com um Microbiorator Automatizado

Resumo

Fonte: Hemmerich, J., et al. Protocolo para Otimização da Produção de Proteínas Heterólogas Utilizando Tecnologia Automatizada de Microbioreator. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra o uso de um microbiorator automatizado para monitorar o crescimento bacteriano e a secreção de proteínas fluorescentes em resposta a diferentes formulações de meio. Uma bactéria geneticamente modificada que expressa uma proteína fluorescente secretora é cultivada sob seleção antibiótica e inoculada em poços variados em nutrientes. Medições ópticas em tempo real da densidade celular e fluorescência permitem a análise comparativa da produção de proteínas em diferentes condições de crescimento.

Protocolo

1. Preparação de materiais e procedimentos de definição
NOTA: Recomenda-se definir e fixar os métodos experimentais em um nível detalhado. Essa padronização garante que diferentes resultados possam ser rastreados até variabilidade biológica intrínseca ou diferentes composições de meio. ​
NOTA: Soluções de estoque de mídia: Prepare soluções individuais de estoque para todos os componentes de mídia investigados. Prepare estoques altamente concentrados para permitir a diluição de diferentes volumes para todos os componentes. Isso significa que, após combinar todas as soluções de stock em seu maior volume de acordo com o plano de projeto, isso não pode exceder o volume final de cultivo, cf. parágrafo "Geração de lista de pipetagem de solução média de stock" passo 1.3.3. Se a adição de uma solução altamente concentrada resultar em um volume de adição muito baixo, por exemplo, < 1/100 do volume final de cultivo, dilua a solução de base de acordo. Por exemplo, neste estudo, um volume de pipeteamento inferior a 10 μL foi definido como inviável. Normalmente, soluções de elementos traço são concentradas até 1.000 vezes em relação à concentração padrão final no meio. É vantajoso concentrar os componentes do meio como múltiplos (X-multiplicados) em relação às concentrações na receita de referência. Ao fazer isso, evitam volumes inviáveis de pipeteamento de decimais fracionários. Receitas detalhadas para todas as soluções padrão do meio CgXII são apresentadas no documento suplementar.

1. Banco de células operacionais (WCB)
Nota: Para cada experimento de crescimento, é usada uma alíquota WCB. Se forem necessários mais alíquotas, use 100 mL de meio de infusão cardíaca cerebral (BHI) em frascos de shake com 1.000 mL com defletores ou inocule múltiplos frascos de shake, que são agrupados antes da adição da solução de glicerol.

1. Prepare colônias únicas da cepa de expressão recombinante C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP43 em placas de ágar (37 g/L de BHI em pó, 20 g/L de ágar, 25 mg/L de kanamicina). O material de revestimento pode vir tanto de transformação recente quanto de uma alíquota criopreservada. Incubar a 30 °C até o aparecimento de colônias individuais; Isso geralmente leva de um a dois dias.
2. Inocule uma cultura em frasco shaker (meio BHI de 50 mL com 25 mg/L de kanamicina, 500 mL frasco com defletor, 250 rpm, diâmetro de agitação de 25 mm, 30 °C) com material da colônia e incube durante a noite (aproximadamente 16 horas).
3. Combine um volume da suspensão celular resultante com um volume de solução estéril de glicerol de 500 g/L e distribua 2 mL de alíquotas em frascos de criopreservação estéreis. Armazene a -80 °C.

2. Protocolo de cultivo MBR
Nota: Para o sistema BioLector MBR empregado neste estudo, luz dispersa (biomassa) e fluorescência GFP são medições de intensidade, que necessitam de um determinado valor de ganho atribuído. Quanto maior o ganho, maior o sinal óptico é amplificado; É também por isso que a luz espalhada e a fluorescência são medidas em unidades arbitrárias (u.a.). Determinar valores adequados de ganho para a detecção de biomassa e GFP em experimentos preliminares, juntamente com frequência de agitação e volume de enchimento adequados para evitar limitação de oxigênio em concentrações mais altas de biomassa durante estágios posteriores do processo. As condições de cultivo empregadas ("Placas de flores", ou seja, MTPs em forma de flor de 48 poços, frequência de agitação de 1.200 rpm, volume de enchimento de 1.000 μL, 10 g/L de glicose como principal fonte de carbono) garantiram cultivos sem oxigênio. Para taxas máximas de transferência de oxigênio resultantes de outras combinações de volumes de enchimento e frequências de agitação em MTPs em formato de flor de 48 poços, estão disponíveis folhas técnicas do fornecedor. Além disso, defeitos de crescimento em culturas individuais podem ocorrer devido a baixas quantidades de substratos secundários (por exemplo, nitrogênio, oligoelementos). Portanto, verifique as concentrações de biomassa ao final do cultivo. Neste estudo, nenhum efeito de crescimento foi observado.

1. Defina o protocolo de cultivo para o sistema MBR ("BioLector") da seguinte forma:
2. Conjunto de filtros 1: Biomassa, ganho 14. Filtro 2: pH, ganho pré-definido. Filtro 3: pO2, ganho pré-definido. 4: GFP, ganho 80.
3. Frequência de tremor: 1.200 rpm.
4. Temperatura: 30 °C.
5. Tempo de ciclo: 15 min.
6. Tempo do experimento: manual (Cultivo não será interrompido automaticamente).

3. Geração de lista de pipeteamento por solução média
Nota: Quase qualquer sistema robótico de manuseio de líquidos é capaz de ler ações de pipeteamento a partir de arquivos externos. Basicamente, a informação mínima necessária é o volume e a posição de transferência da fonte do reagente, assim como o destino de cada um representado por uma posição de material de laboratório no deck robótico e uma cavidade específica dentro do equipamento. No entanto, diferentes sintaxes para diferentes sistemas de manuseio de líquidos devem ser consideradas. A Figura 1 mostra uma estrutura de arquivo de exemplo para o sistema de pipetagem empregado neste estudo.

1. Quatro tipos de soluções de stock são pipetados em cada poço de cultivo:

1. Soluções de stock de componentes de mídia que são variados ("Variações de Ações").
2. Água para compensar os diferentes volumes acumulados dos estoques acima.
3. Uma solução padrão ("Stock de Reposição") contendo todos os componentes fixos. Essa solução de estoque pode ser composta por estocas contendo diferentes componentes que, por exemplo, são armazenadas em diferentes temperaturas ou esterilizadas por diferentes métodos.
4. Inoculum, que deve ser adicionado como último componente e colocado na mesa de trabalho logo antes da adição para evitar que as células se depositem.

2. Por poço de cultivo, calcular os volumes a serem transferidos para todos os componentes do meio de acordo com:

O volume a ser adicionado para certas Ações de Variação pode ser zero, ou seja, quando esse componente específico é omitido.

3. Revise todos os volumes calculados Vi para obter números adequados. Os incrementos de volume em pipetos em passos de volume não devem ser muito pequenos. Se necessário, ajuste a concentração das ações de variação. Por exemplo, o volume mínimo de pipetagem aqui foi definido como 10 μL, e o incremento mínimo foi definido como 5 μL. Em geral, esses volumes devem ser definidos com base na precisão e exatidão experimentalmente determinadas para a estação de manuseio de líquidos utilizada.

4. Calcule o volume do Stock de Repouso contendo os componentes fixos para todos os poços da seguinte forma:

onde é usado o volume máximo acumulado do Stock de Variação. Consequentemente, calcule as concentrações necessárias dos componentes fixos no Stock de Repouso da seguinte forma:

Prepare o Rest Stock conforme corresponda.

5. Por poço de cultivo, calcule o volume de água a ser adicionado da seguinte forma:

6. Por poço de cultivo, liste todos os volumes a serem adicionados na seguinte ordem de adição: V_H2O, V_RestStock, V_i,_{V Inok}. Formate a lista de pipeteamento de acordo com as especificações da estação de manuseio de líquidos, como mostrado, por exemplo, na Figura 1.

2. Cultura de sementes, preparação automatizada de mídia e início da cultura principal

1. Crie um protocolo para o robô de manuseio de líquidos. Veja as Figuras 2 e 3 para um protocolo de exemplo para um sistema "Janus", implementado no software correspondente "WinPREP". O protocolo deve considerar os seguintes aspectos:

1. Incluir um tempo suficiente de uso de carcaça estéril antes da preparação para a mídia.

2. Inclua uma limpeza e lavagem excessiva inicial de todas as pontas e tubos de pipetagem.

3. Escolha recipientes de laboratório apropriados para soluções de estoque. Aqui, placas de poço profundo com 12 colunas são adequadas para armazenamento de Variações de Stocks, pois todas as oito pontas de pipetagem podem mergulhar em disposição paralela nas colunas do poço. Isso acelera muito a preparação da mídia. Se tubos de reagente de 15 mL ou 50 mL forem usados como reservatórios, apenas uma ponta de pipetagem pode mergulhar nela de cada vez. Para outros estoques, como água e calhas de repouso, são usados calhas de 100 mL, pois essas soluções de estoque exigem volumes maiores no total.

4. Fornecer um volume total suficiente para cada solução de estoque para compensar volumes de resíduos, compensações de altura para pipetagem, etc.

5. Insira um pedido do usuário antes da etapa de inoculação, garantindo que essa etapa seja realizada imediatamente antes do procedimento de cultura de sementes.

2. Prepare todas as soluções de estoque de forma estéril e armazene até o uso, em recipientes apropriados, por exemplo, tubos de ensaio estéreis de 15 mL e 50 mL.
3. Esterilize as placas profundas do poço para armazenamento em solução de estoque em uma mesa de trabalho, por exemplo, limpando com etanol 70% e secando posteriormente em um exaustor de fluxo laminar.
4. Inicie a cultura das sementes inoculando um meio BHI de 50 mL contendo 25 mg/L de kanamicina com uma alíquota do WCB. Antes do cultivo do MBR, prepare um inoculo fresco e vital a partir de culturas de sementes que crescem exponencialmente em quantidade suficiente.
5. Coloque todo o material de laboratório necessário na mesa de trabalho robótica e despeje as soluções de estoque no material correspondente.
6. Inicie o fluxo de trabalho robótico para a preparação do meio, para que a última etapa (inoculação) seja alcançada a tempo com o início da cultura das sementes. O tempo total de execução do fluxo de trabalho robótico precisa ser avaliado antecipadamente. Aqui, o tempo total de execução foi de aproximadamente 1,5 h.
7. Amostre a cultura de sementes após aproximadamente 2 horas, depois a cada hora, para monitorar o crescimento por densidade óptica (OD₆₀₀). Após aproximadamente 5 horas, a cultura atinge 3-4 OD₆₀₀ e é usada para inocular as culturas principais.
8. Coloque a cultura de sementes sobre a bancada de trabalho do manuseador de líquidos e continue o protocolo de preparação do material. Cultivo de focas MTP após inoculação.
9. Coloque o MTP de cultivo selado no dispositivo BioLector e inicie o protocolo de cultivo pré-definido.
10. Descarte as soluções restantes de estoque, conforme as regulamentações de biossegurança se necessário, e semeie a cultura a partir da bancada robótica. Limpe o material de laboratório reutilizável e inicie o protocolo de descontaminação do manipulador de líquidos.

Resultados

Figura 1: Captura de tela da lista de pipeteamento de volume para análise de sensibilidade. As entradas na primeira coluna atribuem um identificador único a todos os volumes de uma linha; esse identificador é o número do poço MTP do MTP de ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BioLector	M2P-Labs	G-BL-100
Prato de flores	M2P-Labs	MTP-48-BOH	Para cultivo no dispositivo BioLector
Folha de vedação	M2P-Labs	F-GP-10	Selagem estéril para Flowerplate
MATLAB	Mathworks	2016b
KriKit	Forschungszentrum Jülich	N/A	Disponível gratuitamente, instalação do MATLAB necessária
Robô pipetador Janus	Perkin Elmer	N/A	Inclui instalação de software "WinPrep"
Microplaca de poço profundo de 12 colunas	E&K Scientific	EK-2034	Contêiner para soluções de material médio
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP	N/A	N/A	Carrega plasmídeo pEKEx2 com fusão do gene GFP e do peptídeo sinal PhoD de B. subtilis como inserto de expressão. O plasmídeo proporciona resistência à kanamicina. Descrito e publicado por Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)