Criopreservação de longo prazo de cepas cianobacterianas usando glicerol ou dimetil sulfóxido

Resumo

Fonte: Lea-Smith, D. J., et al. Geração de mutantes marcados e sem marcadores em espécies cianobacterianas modelo. J. Vis. Exp. (2016)

Este vídeo demonstra a criopreservação de cepas cianobacterianas combinando suspensões celulares concentradas com glicerol ou DMSO e armazenando-as em baixas temperaturas, permitindo a manutenção a longo prazo de culturas viáveis para fotossíntese e estudos genéticos.

Protocolo

1. Preparação de Mídia Cultural

1. Preparar o BG11 médio
   1. Prepare soluções de material de 100x BG11, elementos traço e coronha de ferro (Tabela 1).
   2. Prepare soluções separadas de estoque fosfato, carbonato de sódio (Na₂CO₃) estoque N-[Tris(hidroximetil)metilo]-2-ácido aminoetanossulfônico (TES) tampão e bicarbonato de sódio (_{NaHCO 3}) (Tabela 1).
   3. Autoclave os estoques de fosfato e Na₂CO₃ . Esterilize o TES buffer e o_{NaHCO 3} com filtros de 0,2 μm.
   4. Prepare BG11 combinando 976 ml de água, 10 ml de 100x BG11, 1 ml de oligoelementos e 1 ml de ferro, e autoclave a solução. Depois que essa solução esfriar até a temperatura ambiente, adicione 1 ml de caldo fosfatado, 1 ml de caldo Na₂CO₃ e 10 ml de_{NaHCO 3}.
   5. Para o meio sólido BG11, adicione 15 g de ágar e 700 ml de água em um frasco. Ao segundo frasco, adicione 3 g de tiosulfato de sódio (Na₂S₂O₃), 226 ml de água, 10 ml de 100x BG11, 1 ml de oligoelementos e 1 ml de ferro. Autoclave ambas as soluções. Depois que essas soluções esfriarem até a temperatura ambiente, misturem-nas e adicionem 1 ml de caldo fosfatado, 1 ml de caldo Na₂CO₃ , 10 ml de tampão TES e 10 ml de_{NaHCO 3}.
      NOTA: As soluções são preparadas separadamente para evitar a precipitação de certos sais.
2. Para a seleção da sacarose, prepare uma solução de sacarose a 50% (p/v). Filtre, esterilize a solução com filtros de 0,2 μm e adicione ao BG11 (100 ml de 50% de sacarose a 900 ml de BG11) para produzir placas de BG11/5% de sacarose.
   NOTA: Não adicione NaHCO₃ às placas de ágar de sacarose BG11/5%. Adicione Na₂CO₃ normalmente.
3. Para o cultivo de Synechococcus, adicione 10 ml de 1 M 4-(2-hidroxietil)piperazina-1-ácido etanossulfônico, N-(2-hidroxietil)piperazina-N′-(2-ácido etanossulfônico) (HEPES) e 1 ml de vitamina B12 (Tabela 1) a 1 L de meio BG11.
   NOTA: A transformação de cepas cultivadas em meios BG11 comercialmente disponíveis é significativamente menos eficiente do que nas receitas de mídia BG11 descritas aqui e, portanto, não é recomendada.

2. Armazenamento de Longo Prazo das Cepas

1. Prepare uma nova cultura da cepa inoculando um laço cheio de células em 30-50 ml de meio BG11. Cultive a cultura por 3-4 dias até OD_750nm = 0,4 a 0,7.
2. Lave as células uma vez com BG11 e ressuspenda em ~2 ml de BG11.
3. Adicione 0,8 ml de células concentradas em um único tubo. Depois, adicione 0,2 ml de glicerol 80% esterilizado com filtro.
4. Opcional: Adicione 0,93 ml de células concentradas a outro tubo. Adicione 0,07 ml de DMSO a este tubo.
   CUIDADO: DMSO é tóxico e deve ser tratado com a proteção adequada.
5. Armazene ambos os tubos a -80 °C. Para reviver as cepas, remova o tubo e raspe algumas células com um palito de dente romba para uma placa de ágar, sem antibióticos. Saia normalmente usando um laço estéril.

Tabela 1: Soluções utilizadas neste estudo

Receitas de solução de estoque
Químico	Quantia (g)
100x BG11 (por L)
NaNO3	149.6
MgSO4,7H 2O	7.49
CaCl2.2H 2O	3.6
Ácido cítrico	0.6
Adicione 1,12 ml 0,25 M Na2EDTA, pH 8,0
0,25 M Na2EDTA, pH 8,0 (por 100 ml)
Na2EDTA	9.3
Elementos traço (por 100 ml)
H3BO3	0.286
MnCl2.4H 2O	0.181
ZnSO4.7H 2O	0.022
Na2MoO 4,2H 2O	0.039
CuSO4.5H 2O	0.008
Co(NO3)2.6H 2O	0.005
Papel de ferro (por 100 ml)
Citrato de amônio férrico	1.11
Estoque de fosfato (por 100 ml)
K2HPO 4	3.05
Na2CO3 caldo (por 100 ml)
Na2CO3	2
Tampão TES, pH 8,2 (por 100 ml)
TES	22.9
NaHCO 3 (por 100 ml)
NaHCO3	8.4
HEPES, pH 8,2 (por 500 ml)
HEPES	119.15
Vitamina B12 (por 50 ml)
Cyanocobalamin	0.02
Mídia Luria Bertani (Por 500 ml)
Caldo Luria Bertani	12.5
1 MMgCl 2 (por 100 ml)
MgCl 2,6H 2O	20.33
Solução A (Por 200 ml)
MnCl2.4H 2O	0.395
CaCl2.2H 2O	1.47
2-(N-Morfolino)ácido etanosulfônico hidratado, 4-Ácido morfolineanosulfônico (MES)	0.4265
Solução A + glicerol
Solução A de 10 ml
1,5 ml glicerol

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
NaNO₃	Sigma	S5506
MgSO₄·7H₂O	Sigma	230391
CaCl₂	Sigma	C1016
Ácido cítrico	Sigma	C0759
Na₂EDTA	Pescador	EDT002
H₃BO₃	Sigma	339067
MnCl₂·4H₂O	Sigma	M3634
ZnSO₄·7H₂O	Sigma	Z4750
Na₂MoO₄·2H₂O	Sigma	331058
CuSO₄·5H₂O	Sigma	209198
Co(NO₃)₂·6H₂O	Sigma	239267
Citrato de amônio férrico	Sigma	F5879
K₂HPO	Sigma	P3786
Na₂CO₃	Pescador	SODC001
TES	Sigma	T1375
NaHCO₃	Pescador	SODH001
HEPES	Sigma	H3375
Cyanocobalamin	Sigma	47869
Na₂S₂O₃	Sigma	72049
Bacto agar	BD	214010
Sacarose	Pescador	SUC001
Placa de Petri de 90 mm com tripla ventilação	Greiner	633185
Filtros de 0,2 μm	Sartorius	16534
Frascos cônicos de 100 ml	Pyrex	CON004
Parafilm M 100 mm x 38 m	Bemis	FIL003
A DNA polimerase de alta fidelidade de Phusion	Phusion	F-530
Agarose	Melford	MB1200
Kit de purificação de DNA	MoBio	12100-300
Endonucleases de restrição	NEB
Ligase T4	Termo Científica	EL0011
Caldo Luria Bertani	Invitrogen	12795-027
MES	Sigma	M8250
Sulfato de kanamicina	Sigma	60615
Ampicilina	Sigma	A9518
Kit de minipreparação de plasmídeos GeneJET	Termo Científica	K0503
Tubo de fundo arredondado de 14 ml	Falcão BD	352059
GoTaq G2 Flexi DNA polimerase	Promega	M7805
Contas de vidro de 425-600 μm	Sigma	G8772
Glicerol	Sigma	G5516
DMSO	Sigma	D8418
Lâmpadas fluorescentes	Gro-Lux	69
Fotobiorreator multitron HT	Infors