Modelagem da Fagocitose Mediada por Complemento Usando Glóbulos Vermelhos Opsonizados In Vitro

Resumo

Fonte: Nagre, N., et al. Macrófago alveolar, fagocitose e eliminação bacteriana em camundongos. J. Vis. Exp. (2019).

Este vídeo demonstra a avaliação da fagocitose mediada pelo receptor do complemento usando glóbulos vermelhos de ovelha opsonizados com IgM e complemento, seguida de sua absorção por macrófagos de camundongos. A extensão da fagocitose é quantificada medindo um produto cromogênico azul formado por oxidação catalisada por hemoglobina do diaminofluoreno.

Protocolo

1. Fagocitose mediada por FcγR e CR

1. Para a opsonização, incube 2 x 10⁸ glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs) com 50 μL de anti-SRBC-IgM de coelho ou 50 μL de anti-SRBC-IgG de coelho por 30 minutos em temperatura ambiente.
2. Incubar SRBCs opsonizados com IgM com 50 μL de soro humano deficiente em C5 (C5D) por 30 minutos a 37 °C para fixar os fragmentos do complemento C3b e C3bi em SRBCs revestidos com IgM.
3. Semeie células macrófagas murinas (células MH-S) (10.000 células/poço) em uma placa de 96 poços e incube durante a noite para obter uma confluência de ~70%. Adicione 100 μL de 1 x 10 SRBCs^{opsonizados de 7}/mL a cada poço de células MH-S e incube por 1 hora a 37 °C. Lave os SRBCs não ligados muito rapidamente (~1 min) com 100 μL de tampão de lise de cloreto de amônio-potássio (ACK).
4. Lisar as células com 0,1% de SDS e adicionar 50 μL de 2,7-diaminofluoreno (DAF) contendo 3% de peróxido de hidrogênio e 6 ureia M. Meça a absorção da formação de azul de flúor catalisada pela hemoglobina em 620 nm.
5. Determine o número de SRBCs usando uma curva padrão com valores de absorção de 620 nm com um número conhecido de SRBCs. Da mesma forma, processar células MH-S incubadas com SRBCs não opsonizados para usar como controles negativos.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
2,7-diaminofluoreno (DAF)	Sigma-Aldrich	D17106	Grau em Biologia Molecular
70% de etanol	Decon Labs Inc.	18C27B	Grau analítico
Placa de 96 poços	Corning	3603	Grau em Biologia Celular
Buffer de lise ACK	Tecnologias de Vida	A10492	Grau em Biologia Molecular
Soro deficiente em C5	Sigma-Aldrich	C1163	Reagente bioquímico
Centrífuga	Labnet International	C0160-R
Citocentrífuga Cytospin 4	Thermofisher Scientific	A78300101 Edição 11
Mídia de Cultura Celular DMEM	Gibco	11995-065	Grau em Biologia Celular
FBS	Atlanta Biologicals	S11550	Grau em Biologia Celular
Citômetro de Fluxo	BD em Biociências	FACSCalibur
Flow Jo Software	FlowJo, LLC
Pinças	Dumont	0508-SS/45-PS-1	Adequado para dissecação de animais de laboratório
Prato de fundo de vidro	MatTek Corp.	P35G-0.170-14-C	Grau em Biologia Celular
Seringa de Alta Pressão	Penn-Century	FMJ-250	Adequado para uso com animais de laboratório
Homogeneizador	Omni International	TH-01
Peróxido de hidrogénio	Sigma-Aldrich	H1009	Grau analítico
Microscópio de Fluorescência Invertida	Olympus	IX73
MicroSpray Aerossolizador	Penn-Century	IA-1C	Adequado para uso com animais de laboratório
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	P6148	Grau de reagente
PBS	Gibco	20012-027	Grau em Biologia Celular
coelho anti-SRBC-IgG	MP Biomédicos	55806	Adequado para imunoensaios
coelho anti-SRBC-IgM	Laboratórios Cedarline	CL9000-M	Adequado para imunoensaios
Tesoura	Miltex	5-2	Adequado para dissecação de animais de laboratório
glóbulos vermelhos de ovelha (SRBCs)	MP Biomédicos	55876	SRBCs lavados e preservados