Localização Bacteriana e Interação do Hospedeiro em Tecido Pulmonar Humano por Imagem

Resumo

Fonte: Mills, B., et al., Triagem Óptica de Novas Sondas Específicas para Bactérias em Tecido Pulmonar Humano Ex Vivo por Endomicroscopia a Laser Confocal. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra imagens em tempo real de Staphylococcus aureus marcado fluorescentemente em suspensão e tecido pulmonar usando microscopia de fluorescência confocal fibrada.

Protocolo

1. Coleta de dados com endomicroscopia a laser confocal (CLE)
   1. Após a configuração, uma janela para selecionar o local de armazenamento e o prefixo do arquivo será aberta. Selecione a pasta desejada para armazenamento de dados e nomeie o prefixo de acordo.
   2. Coloque os pedais para que o operador possa acessá-los facilmente. Pedal esquerdo: laser ligado/desligado; pedal central: pausa; Pedal direito: Gravar/Stop.
      NOTA: Os controles a laser também podem ser acessados por meio de controles na tela.
   3. Clique em 'iniciar' na tela ou aperte o pedal esquerdo para ligar o laser. Isso iniciará a aquisição e obtenção de imagens usando 100% de potência a laser e uma taxa de quadros de 12 quadros/s (configurações padrão).
      NOTA: Para outras aplicações, essas configurações podem ser alteradas na tela, se necessário, dependendo do tipo de amostra.
   4. Fotografe cada uma das amostras de suspensão bacteriana.
      1. Insira a extremidade distal da fibra de imagem FCFM (microscopia de fluorescência confocal com fibra) e mova a fibra lentamente pela suspensão para examinar a amostra.
      2. Grave vídeos de qualquer duração (até 10 minutos) pressionando o pedal direito ou selecionando os controles de gravação na tela, enquanto a fibra se move lentamente ao redor da amostra.
      3. Limpe a extremidade distal da fibra de imagem FCFM com 8% de H_{, 2O2} e tecidos de limpeza de lentes entre as amostras. ​
         NOTA: Durações típicas de vídeo de 10 a 30 s são suficientes para imagens in vitro .
   5. Faça uma imagem de cada amostra de tecido pulmonar.
      1. Insira a extremidade distal da fibra de imagem FCFM na amostra, garantindo contato direto entre a extremidade da fibra e o tecido. Mova delicadamente a ponta da fibra de imagem para analisar a amostra.
         NOTA: Levantar a ponta da fibra para longe do tecido remove o tecido do plano focal; no entanto, isso pode ser usado para imagear bactérias marcadas que não estão aderidas ao tecido.
      2. Grave vídeos de qualquer duração (até 10 minutos) pressionando o pedal direito ou selecionando os controles de gravação na tela, enquanto a fibra se move lentamente ao redor da amostra.
         NOTA: Normalmente, vídeos de 30 s são suficientes para imagens ex vivo em tecidos.
      3. Limpe a extremidade distal da fibra de imagem FCFM com tecidos de limpeza de lentes e 8% de_H2O₂ entre as amostras.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1-14 Microfúgio	SciQuip	90616	Microcentrífuga de bancada pequena
Placa de 96 poços	Corning	3370	Placa de ensaio
Calcein AM	Sigma Aldrich	17783	Corante fluorescente comercial
Cellvizio 488 nm Research CLE	Mauna Kea Technologies	LC-0001-488	Dispositivo de endomicroscopia a laser confocal
Cletop-S	Cletop	14110601	Limpador de fibras
Eppendorf (1,5 mL)	Eppendorf	30120086	Tubo de microfuga de 1,5 mL
Soro Fosfato Gibco Tamponado	Thermo Fisher Scientific	10010023	PBS - mídia de lavagem
IC-Viewer	Mauna Kea Technologies	LW-0001	Software de coleta e processamento de dados para o sistema de pesquisa CellVizio 488 nm
Pesquisa não padrão AlveoFlex 488 nm	Mauna Kea Technologies	MP-0002-AF3	Fibra de microscopia de fluorescência confocal fibrada
Kit Quanti 488 nm	Mauna Kea Technologies	LQ-0005	Kit de calibração para o sistema CellVizio 488
S. aureus ATCC 25923	ATCC	25923	Cepa bacteriana usada neste estudo
Cuvette semi-micro de espectrofotometria	Sigma Aldrich	C5416-100EA	Para espectrofotometria
Conforto do termomisturador	Eppendorf	41102422	Aquecedor de bancada com tremores