Limpeza Seletiva de Vermes Caenorhabditis para Enriquecimento da Microbiota Intestinal

Resumo

Fonte: Morgan, E., et al. Limpeza Seletiva de Nematoides Selvagens Caenorhabditis para Enriquecer Bactérias do Microbioma Intestinal. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra um protocolo para isolar bactérias intestinais de interesse de vermes selvagens Caenorhabditis . Os vermes são primeiro privados de fome e lavados para eliminar bactérias residuais de alimentação de sua superfície e lúmen intestinal, preservando os microrganismos alvo. Após a limpeza da superfície e múltiplas etapas de rastejamento, as minhocas são dissecadas para extrair intestinos contendo as bactérias de interesse, que são então coletadas e congeladas para armazenamento.

Protocolo

1. Dissecação intestinal e identificação por PCR de espécies microbianas

1. Criar animais a 20 °C por 3-4 dias para permitir que passem fome e reduzir a quantidade de bactérias OP50-1 (cepa OP50-1 de Escherichia coli). Adicione 5 mL de meio M9 à placa de minhocas famintas.

2. Usando uma pipeta de vidro estéril e bulbo, pipete os vermes M9+ da placa e transfira-os para um tubo centrífugo estéril de 15 mL.

3. Usando uma centrífuga clínica, centrifuge os vermes no tubo a 1000 x g por 30 s em temperatura ambiente.

4. Usando uma pipeta estéril de 15 mL, remova o sobrenadante do tubo da centrífuga sem perturbar as minhocas vivas no fundo do tubo.

5. Adicione 10 mL de M9 + 0,05% Triton X-100 e incube o tubo em um nutador por 20 minutos para remover microrganismos externos. Repita quatro vezes para lavar as minhocas.

6. Após a última lavagem, usando uma ponta de pipeta estéril, remova o sobrenadante sem perturbar o pellet no fundo em 100 μL da solução.

7. Usando uma ponta de pipeta estéril, transfira M9 e os vermes para uma placa NGM não semeada e deixe a placa secar enquanto os vermes rastejam por 20 minutos para ajudar a remover o OP50-1 da cutícula e do intestino.

8. Adicione 250 μL de M9 à placa seca e use uma pipeta de vidro para transferir M9+ vermes para uma nova placa NGM não semeada. Novamente, deixe o prato secar e deixe as minhocas rastejarem por 20 minutos.

9. Adicione 250 μL de M9 à placa e transfira 100 μL dos minhocas M9 + para um vidro de relógio limpo.

10. Usando duas agulhas de seringa estéreis de 26 G, decapite os nematoides segurando a minhoca com uma agulha e usando a outra agulha para cortar a minhoca. Após a decapitação, o intestino (granular) e a gônada (transparente) do corpo saem naturalmente do corpo.

11. Corte um pedaço do intestino exposto segurando o intestino com uma agulha e cortando com a outra.

NOTA: Se possível, verifique se o microrganismo de interesse ainda está presente em intestinos evertidos usando microscopia Normarski, hibridização fluorescente in situ (FISH) ou imunohistoquímica.

12. Transfira um único intestino dissecado para um tubo de PCR de 0,5 mL contendo 10 μL de água estéril. Repita para um total de pelo menos 5 tubos de PCR (reação em cadeia da polimerase) contendo intestinos de diferentes animais.

13. Congele os tubos de PCR a -80 °C por no mínimo 5 minutos. Retire os tubos de PCR do freezer e descongele as amostras.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agarose	Fisher Scientific	BP1356
10% SDS	Invitrogen	AM9822
Agulha BD PrecisionGlide - 26 G	Fisher Scientific	305115
KH₂PO₄	Fisher Scientific	P-286
NaCl	Fisher Scientific	S-671
NH₄Cl	Fisher Scientific	A-661
Estreptomicina	Millipore-Sigma	S6501-50G
Tetraciclina	Millipore-Sigma	T7660-5G
Triton X-100	Fisher Scientific	BP-151
Óculos de relógio	VWR	470144-850