Hibridização in situ por fluorescência de bactérias intestinais em seções intestinais de camundongos

Resumo

Fonte: Ng, K. M., Tropini, C. Visualização das Interações Microbiota-Hospedeiro Intestinal via Hibridização In Situ por Fluorescência, Coloração por Lectina e Imagem. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra o procedimento de hibridização fluorescente in situ (FISH) para colorir a microbiota intestinal dentro do tecido intestinal do camundongo, hibridizando sondas fluorescentes com rRNA bacteriano (ácido ribonucleico ribossomal) e contracolorindo as estruturas do hospedeiro para análise microscópica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética animal apropriado

1. Coloração bacteriana com FISH (Hibridização fluorescente in situ)
   1. Use um bloqueador líquido ou caneta PAP (caneta barreira hidrofóbica) para limitar a área de expansão do líquido, circulando a área de cada seção de tecido. Certifique-se de que a tinta não entre em contato com a própria seção. Crie um círculo o mais próximo possível de cada seção de tecido sem contato com o tecido para minimizar a área de superfície que precisa ser coberta pela solução de hibridização.
   2. Prepare a solução de hibridização: para cada 50 μL de solução de hibridização pré-aquecida, adicione uma sonda de 0,5 μg (por exemplo, 0,5 μL de sonda de 1 μg/μL). Pipete a solução de hibridização sobre as seções do lâmina (~20 μL/seção, dependendo do tamanho da seção/círculo). Proteja a solução de hibridização e as lâminas da luz a partir desse ponto durante as etapas de incubação e armazenamento.
   3. Certifique-se de que o volume de líquido utilizado cubra toda a seção ao ser sobreposto com uma cobertura plástica flexível. Incube a lâmina em uma câmara úmida para reduzir a evaporação. Crie uma câmara úmida com uma caixa de ponta de pipeta com lenços umedecidos ou papel toalha no fundo, que tenham sido embebidas com excesso de solução de hibridização ou soro salino tamponado com fosfato (PBS) para fornecer umidade. Incube as seções a 45-50 °C, dependendo do conjunto de sondas, por >3 horas.
   4. Aqueça o buffer de lavagem FISH: 20 mM Tris-HCl, pH 7,4; 0,9 M NaCl a 50 °C durante o período de incubação. Prepare um tampão de lavagem suficiente para cobrir as lâminas no pote de Coplin.
   5. Remova as coberturas plásticas; incube as lâminas em um tampão de lavagem FISH em um pote Coplin, ambos pré-aquecidos a 50°C. Coloque o pote Coplin de volta no forno a 50°C por 10-20 minutos. Para amostras grossas, remova as coberturas do pote Coplin adicionando o buffer e soltando suavemente as coberturas para evitar que a fatia se espalhe.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pote de coplin	Fisher	08-813E
Vidro de cobertura, 22 × 22 mm, nº #1	VWR	CA48366-227-1
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542	Resuspenso para 5 mg/mL
Caixa(s) de ponta de pipeta vazia			Para derreter parafina
Sondas FISH
Solução de hibridização FISH	--	--	20 mM de pH 7,4 de Tris–HCl, 0,9 M de NaCl, 0,01% (p/v) de SDS em água livre de nuclease. Adição opcional de formamida de 5–50% (v/v)
Amortecedor de lavagem de peixes	--	--	20 mM Tris–HCl pH 7,4, 0,9 M NaCl
Lectina Ulex Europaeus Agglutinin (UEA-1) marcada fluorescentemente	Laboratórios Vector	FL-1061 (marcado com fluoresceína) ou RL-1062-2 (marcado com rodamina)	A UEA-1 marca glicanos fucosilados, portanto não é apropriada para camundongos livres de germes ou para amostras de hospedeiros deficientes em fucosiltransferase 2 (FUT2).
Pinças
Lábios plásticos flexíveis HybriSlip, 22 x 22 mm × 0,25 mm	Sigma Aldrich	GBL722222	para as etapas de hibridização FISH, podem substituir as coberturas de vidro
Caneta PAP de barreira hidrofóbica ImmEdge	Laboratórios Vector	H-4000
Kimwipes
Contêineres Multipropósito para Armazenamento de Espécimes, 473 mL	Fisher	14-955-117A	Pode substituir por um recipiente de vidro ou polietileno de sua escolha. O metacarno não é compatível com poliestireno ou metal.
Esmalte	Ciências da Microscopia Eletrônica	72180	Qualquer esmalte deve servir
Forno			Faixa necessária: 45-60 °C
PBS, Solução salina tamponada com fosfato (solução 10x)	Fisher	BP3991	Diluir para 1x para o protocolo
Cloreto de sódio	Fisher	S271
Solução de cloridrato de Trizma, 1M Tris-HCl, pH 7,4	Sigma-Aldrich	T2663-1L
Água, livre de nuclease	Fisher	BP2484100