Isolamento baseado em ultracentrifugação das vesículas externas da membrana Legionella pneumophila

Resumo

Fonte: Jung, A. L., et al. Vesículas da membrana externa da Legionella pneumophila : Isolamento e análise de seu potencial pró-inflamatório em macrófagos. J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o isolamento das vesículas de membrana externa (OMVs) da Legionella pneumophila usando centrifugação sequencial, filtração estéril e ultracentrifugação. Os OMVs purificados, enriquecidos em proteínas de membrana e lipopolissacarídeos, são adequados para estudos de interação hospedeiro-patógeno.

Protocolo

1. Cultivar Legionella pneumophila

1. Espalhe a cepa de L. pneumophila Corby (tipo selvagem, WT) em placas de ágar de extrato de levedura de carvão (BCYE) tamponado e incube-as a 37 °C por 3 dias. Inocular 10 mL de caldo de extrato de levedura (YEB) em um OD₆₀₀ de 0,3 com L. pneumophila da placa de pré-cultura; incubar a bactéria a 37 °C em um shaker rotativo (150 rpm) por 6 horas.
2. Verifique a pureza da cultura líquida espalhando 100 μL da suspensão em uma placa de ágar sanguíneo. Incube durante a noite a 37 °C.
3. Adicione a cultura líquida restante a 90 mL de meio YEB fresco e incube em um shaker rotativo (37 °C e 150 rpm) para atingir um OD₆₀₀ de 3,0-3,5, o que leva aproximadamente 16-20 horas.

2. Preparar e Quantificar Vesículas da membrana externa (OMVs) de L. pneumophila

NOTA: Realize todas as seguintes etapas de centrifugação em condições estéreis e a 4 °C.

1. Centrifuge a cultura líquida a 4.000 x g por 20 minutos para pelletar as bactérias. Transfira o sobrenadante para tubos de centrífuga novos, descarte o pellet bacteriano e repita a centrifugação (4.000 x g por 20 minutos). Repita essa etapa uma vez.
2. Filtre estéril o sobrenadante restante duas vezes (tamanho dos poros: 0,22 μm). Transfira o supernadante livre de bactérias para tubos de ultracentrífuga e ultracentrífuga a 100.000 x g por 3 horas.
3. Decante o sobrenadante e descarte-o. Ressuspenda o pellet OMV em soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS) e ultracentrífuga (100.000 x g por 3 horas) para remover proteínas contaminantes e LPS.
4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet OMV em 500 μL de PBS estéril. Estirar 20 μL em uma placa de ágar sanguíneo e em uma placa de ágar BCYE para excluir a contaminação bacteriana das vesículas preparadas. Incube a placa de ágar sanguínea durante a noite e a placa de ágar BCYE por 3 dias (ambas a 37 °C).
   NOTA: A concentração de 100 mL de cultura de L. pneumophila geralmente é de 1 μg/μL. Armazene os OMVs preparados e quantificados a -20 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placa de Petri de 10 cm	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemanha)	82.1473
Rotor 70 Ti	Beckman Coulter Incorporation (Califórnia, EUA)	337922
Cuvetas	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemanha)	67.742
Incubadora Heracell 240i CO₂	Thermo Fisher Scientific Alemanha BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha)	40830469
Heraeus Multifuge X3R	Thermo Fisher Scientific Alemanha BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha)	75004515
Anilha de inoculação	Sarstedt AG & Co KG (Nuembrecht, Alemanha)	86.1567.010
L. pneumophila Corby	---	---
PBS	Biochrom GmbH (Berlim, Alemanha)	L 1825
Agitador rotativo (MaxQ 6000)	Thermo Fisher Scientific Alemanha BV & Co KG (Braunschweig, Alemanha)	SHKE6000
Ultrospec 10	Biochrom Ltd (Cambridge, Inglaterra)	80-2116-30
Filtro estéril (tamanho dos poros: 0,22 μm)	Corning Incorporated (Nova York, EUA)	431096
Carvão ativado	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)	X865.2
Agar-agar, Kobe I	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)	5210.2
Ágar Columbia com 5% de sangue de ovelha	Becton Dickinson GmbH (Heidelberg, Alemanha)	254005
Extrato de levedura	Carl Roth GmbH & Co KG (Karlsruhe, Alemanha)	2363.2