Isolamento e Cultivo de Caenorhabditis elegans - Bactérias Associadas

Resumo

Fonte: Petersen, C. et. al., Isolamento e Caracterização da Microbiota Natural do Nematoide Modelo Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2022)

Este vídeo demonstra o isolamento e o cultivo de espécies bacterianas associadas a Caenorhabditis elegans. Uma lise baseada em contas de C. elegans, seguida de cultivo seletivo, permite o isolamento de diversas cepas microbianas para análise posterior.

Protocolo

1. Isolamento e cultivo de bactérias associadas a nematoides (Figura 1)

1. Para isolar bactérias, prepare uma placa de 96 poços com três esferas estéreis de 1 mm, 20 μL de tampão de M9 de sais médios mínimos (M9) por poço e pipete um nematoide individual lavado para cada poço, transferindo o mínimo de líquido possível.
   NOTA: Alternativamente, as populações de vermes podem ser lavadas das placas com o tampão M9, e ~300 μL de tampão M9 contendo vermes podem ser transferidos para tubos de 2 mL com 10-15 esferas.
2. Quebre os nematoides usando um homogeneizador de esferas (por exemplo, batendo esferas por 3 minutos a 30 Hz). Centrifuge a placa ou tubos brevemente para levar o líquido até o fundo (por exemplo, por 10 s a 8000 x g em temperatura ambiente, RT).
   NOTA: O uso desse método levou ao isolamento de táxons bacterianos semelhantes aos revelados pelo sequenciamento de amplificações de DNA ribossomal 16S (rDNA), sugerindo que o batimento-de-esferas descrito deixa a maioria das células bacterianas intactas.
3. Colete o sobrenadante, dilua-o em série a 1:10 e coloque até 100 μL em placas de ágar de 9 cm.
   1. Para garantir que a maioria das bactérias possa ser cultivada, utilize uma variedade de meios alternativos com diferentes composições nutritivas, incluindo ágar de soja tripticasa diluída (TSA, diluição 1:10), ágar MacConkey, ágar de glicose Sabouraud, agar dextrose batata ou ágar peptona dextrose de levedura.
4. Incube as placas nas condições de temperatura média do local de amostragem (por exemplo, temperaturas entre 15-20 °C para locais temperados) por 24-48 horas.
5. Use a técnica padrão de três faixas e um laço estéril para obter culturas bacterianas puras (Figura 1).
   1. Retire uma única colônia de uma placa usando um laço estéril ou palito de dente e espalhe sobre uma nova placa de ágar contendo o mesmo meio de ágar usado para purificação. Certifique-se de usar apenas cerca de 1/3 da placa.
   2. Ou use um novo laço estéril ou esterilize um laço reutilizável e arraste pelo primeiro traço para criar um segundo traço em outro 1/3 da mesma placa.
   3. Repita esse passo arrastando um laço estéril pela segunda faixa de depressão.
   4. Incube a placa sob as mesmas condições de crescimento usadas para isolamento. Essa técnica deve resultar em colônias individuais crescendo na área da terceira faixa.
      NOTA: Pode ser necessário repetir a etapa de purificação várias vezes, pois isolados naturais tendem a formar biofilmes e/ou agregados.
6. Cultive as colônias puras em meio líquido (do mesmo tipo do meio do ágar) usando a mesma temperatura e tempo de crescimento dos anteriores (passo 1.4)

Resultados

Figura 1: Identificação e isolamento de espécies individuais de bactérias. Nematoides individuais são quebrados usando um homogeneizador de contas, e o DNA é isolado para determinação da espécie via PCR ou sequenciamento. Alternativamente, o mate...