$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.
1. Isolamento da Comunidade Bacteriana Intracelular (CCI): Pipetação oral dos CII
NOTA: Todos os métodos descritos nesta seção passaram por uma avaliação institucional de risco. A pipeteação oral carrega o risco inerente de ingestão da solução que está sendo transferida. Esse risco é amplamente mitigado pelos volumes de nanolitros que este protocolo utiliza, e recomendamos que todos os usuários do protocolo prestem atenção às notas de precaução e prática listadas aqui e na discussão.
- Após as células serem raspadas para o PBS (soro salino tamponado com fosfato), instale o aparelho de micropipetamento oral (Figura 1C).
- Insira a extremidade mais grossa do capilar de vidro puxado (a extremidade não puxada) no plugue de borracha (extremidade branca) do tubo aspirador.
- Insira a extremidade estreita de uma ponta de pipeta de 1 mL na outra extremidade aberta (vermelha) do tubo aspirador, garantindo um encaixe apertado.
- Insira a ponta estreita de uma pipeta aspiradora de 2 mL na extremidade aberta e mais larga da ponta da pipeta de 1 mL, garantindo novamente um encaixe apertado.
NOTA: A configuração resultante permite que o pesquisador faça pipeta por boca a partir da extremidade mais larga e aberta da pipeta aspiradora para criar uma força de sucção suave a partir da extremidade estreita do tubo capilar na outra extremidade do aparelho. - Teste o aparelho final de micropipetamento da boca usando uma placa de Petri de 100 mm contendo água deionizada fresca. Uma leve ação de sucção na extremidade aberta da pipeta aspiradora (semelhante a beber uma bebida com canudo) deve aumentar o nível de líquido no capilar, mas não fazer com que a água desionizada transborde para o tubo aspirador. Use uma mão para controlar o tubo capilar, enquanto a outra para ajustar a posição da placa de Petri.
NOTA: A força de sucção necessária para pipetar um único IBC por boca varia entre os pesquisadores. No entanto, recomenda-se que cada pesquisador que tente essa técnica comece com uma sucção fraca e a aumente lentamente se nenhum líquido estiver fluindo pelo capilar. Não há necessidade de uma força maior do que sugar um canudo para beber. Se o capilar não parecer captar líquido durante o teste no passo 1.1.4, é possível que o capilar ou o tubo aspirador estejam obstruídos e precisem ser substituídos. Recomenda-se ainda que todos os novos pesquisadores primeiro pratiquem o controle da sucção no aparelho de pipetagem oral usando água esterilizada. Além disso, observe que o controle do volume ocupado pelo aparelho de pipeteamento oral é feito pelo uso da língua do pesquisador. A língua pode ajustar finamente a força da sucção aplicada, além de funcionar como uma parada de emergência. - Após alcançar a captação bem-sucedida do líquido, teste a capacidade de expulsá-lo pelo capilar soprando suavemente na extremidade aberta da pipeta aspiradora. Certifique-se de que nenhuma bolha seja criada durante a expelação do líquido para evitar a contaminação dos IBCs durante a etapa 1.5.
NOTA: Assim como na sucção, a força da pressão positiva aplicada pelo pesquisador para expulsar o IBC para dentro do tubo da centrífuga variará entre os pesquisadores. Recomenda-se que pesquisadores novos nesse protocolo pratiquem o passo 1.1 alguns dias antes da infecção real. Uma sugestão para praticar micropipetamento oral é praticar a transferência de pequenos volumes de água esterilizada misturada com algumas gotas de corante alimentício (para visibilidade) usando o aparelho de micropipeta bucal.
- Coloque a suspensão de células raspadas sob o microscópio dissecante e identifique os IBCs como grandes agregados fluorescentes (Figuras 1A, B). A faixa ideal de ampliação é de 20 a 40x. Mergulhe a extremidade fina do capilar de vidro em um tubo novo de PBS por 1 segundo para reduzir a absorção de volume indesejado por ação capilar.
- Olhando pelo microscópio, identifique o IBC de interesse e leve lentamente a extremidade aberta do tubo capilar em direção ao IBC. Use a extremidade fina do capilar de vidro para varrer células extras próximas a cada IBC, a fim de evitar a aspiração de duas ou mais células, ou para quebrar agregados maiores de células.
- Ao observar pelo microscópio, aplique uma força de sucção muito pequena na extremidade oposta (pipeta aspirante) do aparelho de micropipetamento oral para guiar o IBC até o capilar de vidro.
- Após pegar o IBC, mova o capilar para um tubo vazio de centrífuga de 1,5 mL e aplique uma leve pressão positiva para expulsar a gotícula e o IBC para o tubo da centrífuga (Figura 1D).
- Repita os passos 1.3-1.6 no maior número possível de IBCs necessários da bexiga atual, antes de prosseguir para a próxima bexiga. Troque frequentemente as pipetas e capilares aspiradores para evitar o acúmulo de saliva.
ATENÇÃO: Ao trabalhar com cepas infecciosas (ou clínicas) de bactérias, monitore constantemente o nível de solução nos capilares. Não deixe o nível de líquido que está sendo pipetado transbordar da borda do capilar para o tubo aspirador. Se isso acontecer, troque imediatamente para outro tubo aspirador e descarte a configuração anterior. - Repita os passos 1.2-1.6 em todas as bexigas colhidas, ou até que um número suficiente de amostras biológicas tenha sido coletado para o grupo experimental.
- (Opcional) Repita os passos 1.6 e 1.7 até que todos os grupos experimentais (ou camundongos) tenham sido eutanasiados e amostras biológicas suficientes tenham sido coletadas de cada grupo.
