Detecção da expressão do gene alvo em um cérebro de camundongo infectado por bactérias

Resumo

Fonte: Zhang, S., et al. Rota Subaracnoidal Intracraniana de Infecção para Investigar Papéis de Streptococcus suis Biofilms em Meningite em um Modelo de Infecção de Camundongo. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a detecção da expressão gênica alvo em um cérebro de camundongo infectado por bactérias. O RNA é extraído, tratado com uma enzima degradante do DNA e transcrito reversamente em cDNA. O cDNA é amplificado por ciclo térmico com primers específicos de cada gene, enquanto um corante que liga o DNA se liga ao DNA amplificado, emitindo fluorescência. Os sinais de fluorescência são analisados para confirmar a presença do gene alvo.

Protocolo

1. Preparação de Bactérias

Nota: A cepa virulenta P1/7 do serotipo 2 do Streptococcus suis (S. suis) foi isolada de um porco doente com meningite. A cepa P1/7 foi cultivada em caldo Todd-Hewitt (THB, fórmula por litro de THB: Infusão Cardíaca, 3,1 g; neopeptona, 20,0 g; dextrose, 2,0 g; cloreto de sódio, 2,0 g; fosfato dissódico, 0,4 g; carbonato de sódio, 2,5 g) e colocada em ágar Todd-Hewitt (THA, fórmula por litro de THA: Infusão Cardíaca, 3,1 g; neopeptona, 20,0 g; dextrose, 2,0 g; cloreto de sódio, 2,0 g; fosfato dissódico, 0,4 g; carbonato de sódio, 2,5 g; ágar, 15,0 g) a 37 °C e 5% de CO₂.

1. Coleção de células planctônicas da cepa P1/7
   1. Colete 5 mL de células planctônicas de culturas em fase média logaritarina (OD₆₀₀=0,6), centrifuge por 3 minutos a 8000 × g e lave 3 vezes com soro salino tamponado com fosfato (PBS).
   2. Ressuspenda as células com 5 mL de glicerol a 25% em THB, aliquota em 5 tubos e depois armazene a -80 °C.
2. Coleta de células de estado do biofilme da cepa P1/7
   1. Pegue 20 mL de uma cultura durante a noite e adicione 180 mL de THB fresco; divida a cultura diluída igualmente em 10 placas redondas de cultura e, em seguida, coloque as placas em uma incubadora a 37 °C em 5% de_CO2 por 24 horas.
   2. Após a incubação, agite a placa suavemente para ressuspender as bactérias que não aderiram à placa e, em seguida, descarte o sobrenadante por aspiração.
      NOTA: Agite a placa suavemente e evite resuspender o sedimento.
   3. Adicione 5 mL de PBS para colher as células do estado do biofilme, ressuspenda completamente o sedimento e então transfira a amostra para um novo tubo.
   4. Sonice as células do estado do biofilme a partir da última etapa com os seguintes parâmetros: 60 W, 4 ciclos, 5 s ligado e 10 s desligado.
   5. Centrifuge por 3 minutos a 8000 × g e armazene o sobrenadante a -80 °C.
      NOTA: O sobrenadante pode conter componentes de biofilme e pode ser usado para ressuspender as bactérias do biofilme antes da infecção, conforme descrito nos experimentos com animais (Passo 2).
   6. Ressuspenda o sedimento com 10 mL de glicerol a 25% em THB e então armazene as células do estado do biofilme a -80 °C.

2. Experimentos com Animais

1. Use FPS de camundongos BALB/c fêmeas de 6 semanas neste estudo. Infectar todos os camundongos pela via subaracnoidal intracraniana, cujo local de injeção está localizado a 3,5 mm rostral da brema.
   1. Para análise histopatológica, infectar dois grupos de camundongos (5 camundongos por grupo) usando células planctônicas ou células do estado de biofilme em uma dose de 3 × 10^{unidades formadoras de 7} colônias (UFC), e outros 5 camundongos foram injetados com PBS como controle.
   2. Para a detecção da expressão de mRNA de TLR2 e citocinas no cérebro, infecte dois grupos adicionais de camundongos (6 camundongos por grupo) usando células planctônicas ou células do estado de biofilme em uma dose de 3 × 10⁷ CFU.
   3. Determine o número de bactérias viáveis aplicando diluições seriadas sobre a THA.
   4. Eutanasie todos os camundongos às 12 horas após a infecção para pesquisas adicionais. ​
      NOTA: O glicerol presente no meio original deve ser removido antes da infecção. Tanto as células planctônicas quanto as células do estado de biofilme recuperadas de -80 °C são lavadas 3 vezes com PBS. Em seguida, as células planctônicas são ressuspensas com PBS e diluídas na dose adequada para infecção; As células do estado de biofilme são ressuspensas com o sobrenadante armazenado (a partir da etapa 1.2.5) e diluídas até a dose adequada para infecção. O volume de infecção não deve ultrapassar 50 μL.
2. Detecção da expressão de mRNA de TLR2 e citocinas no tecido cerebral
   1. Extraia o RNA total do tecido cerebral usando um kit de extração de RNA.
      1. Para cada camundongo, use todo o tecido cerebral para extrair RNA. Divida todo o tecido cerebral em 5 tubos. Pegue até 100 mg de tecido cerebral e adicione 1 mL de solução de lise a cada tubo contendo a matriz de lisis fornecida pelo kit.
      2. Processe o tubo em um homogeneizador por 40 s na configuração 6,0, e então centrifuge o tubo a 12000 × g e 4 °C por 5 minutos.
      3. Após a centrifugação, transfira a fase superior para um novo tubo microcentrífuga.
      4. Incubar a amostra transferida por 5 minutos em temperatura ambiente; adicione 300 μL de clorofórmio, faça vórtice por 10 s e depois incube por 5 minutos em temperatura ambiente.
      5. Centrifuge o tubo a 12000 × g e 4 °C por 5 minutos. Transfira a fase superior para um novo tubo.
      6. Adicione 500 μL de etanol absoluto frio ao tubo antes de invertê-lo 5 vezes e depois armazene a amostra a -20 °C por pelo menos 1 hora.
      7. Centrifuge o tubo a 12000 × g e 4 °C por 15 minutos e remova o sobrenadante. Lave o pellet com 500 μL de etanol frio a 75% em água livre de RNase (_H2O).
      8. Remova o etanol, seque o pellet ao ar por 5 minutos em temperatura ambiente e ressuspenda o RNA em 100 μL de_H2Olivre de RNase.
      9. Incube o RNA por 5 minutos em temperatura ambiente e determine a concentração de RNA usando um bioanalisador de RNA.
   2. Realize a síntese complementar de DNA (cDNA), incluindo a eliminação do DNA genômico (gDNA), utilizando um termociclador com kit de reagentes de transcrição reversa (RT).
      1. Adicione 1 μg de RNA a um tubo contendo 2 μL de 5x tampão de eliminação de gDNA, 1 μL de enzima de eliminação de gDNA e_H2Olivre de RNase até que o volume atinja 10 μL. Incube por 2 minutos a 42 °C.
      2. Adicione 10 μL de mistura master (1 μL de enzima RT Mix I, 1 μL de mistura de primer RT, 4 μL de 5x Buffer 2 e 4 μL de H₂livre de RNase) à solução de reação a partir da última etapa e depois misture suavemente. Proceda imediatamente com a reação RT: 37 °C por 15 minutos e depois 85 °C por 5 segundos.
      3. Realize a análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase em tempo real (RT-qPCR) usando uma máquina de PCR em tempo real com um kit SYBR RT-qPCR. Adicione 10 μL de 2x enzima, 0,8 μL de primer direto, 0,8 μL de primer reverso, 0,4 μL de 50x ROX Reference Dye II, 2 μL de molde de cDNA e H_2Olivre de RNase até atingir um volume total de 20 μL.
      4. Execute cada amostra em triplicado usando os seguintes parâmetros térmicos: 30 s a 94 °C, seguido por 40 ciclos de 5 s a 95 °C e 34 s a 60 °C, com um estágio final de 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C e 15 s a 95 °C. Primers para RT-qPCR estão listados na Tabela 1. Genes de manutenção B2m e rRNA 18s foram usados como controles internos.
   3. Calcule a variação relativa da dobra com base no método ^2-ΔΔCt .

Tabela 1: Espoletas para RT-qPCR.

Nome do Guia	Sequência (5'-3')	Símbolo genético
IL-6 avançado	CTTCCATCCAGTTGCCTTCT	Il6
Reverso do IL-6	CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG	Il6
TLR2 para frente	CACTATCCGGAGGTTGCATATC	Tlr2
TLR2 reverso	GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC	Tlr2
Atacante CCL2	CTCACCTGCTGCTACTCATTC	Ccl2
CCL2 reverso	ACTACAGCTTTTTTGGGACAC	Ccl2
TNF-α adiante	TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT	Tnf
Reverso TNF-α	GAGGTTGACTTTTTCCTGGTATG	Tnf
β2m para frente	GGTCTTTCTGTGTGCTTGTCT	B2m
β2m reverso	TATGTTCGGCTTCCCATTCTC	B2m
Atacantes de 18	GTAACCCGTTGAACCCCATT	18s rRNA
18s reverso	CCATCCAATCGGTAGTAGCG	18s rRNA

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caldo Todd Hewitt (THB)	Becton, Dickinson e Companhia	DF0492078	Dissolva 30 g do pó em 1 L de água purificada. Autoclave a 121° por 15 minutos.
Agar	DSBIO	16C0050	Dissolva 15 g do pó em 1 L de THB. Autoclave a 121° por 15 minutos.
Sistema de Purificação de Água de Referência Milli-Q	Merck KGaA	Z00QSVCUS	Sem Dnase/Rnase
NaCl	Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd	10019318
Na₂HPO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009012-01-09
KCl	Xilong Scientific Co., Ltd	9009017-01-09
KH₂PO₄	Xilong Scientific Co., Ltd	9009019-01-09
KOH	Xilong Scientific Co., Ltd	9009014-01-09
Glicerol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10010618	Diluído com igual volume de água purificada, autoclave a 121° por 15 minutos
4% de paraformaldeído	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	80096675
25% de glutaraldeído	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	30092436	Diluído 10 vezes com água purificada para fixação.
Etanol	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10009218
Clorofórmio	Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd	10006818
Esptrofotômetro	DeNovix Inc.	DS-11+
Triturador de células por ultrassom	NingBo Scientz Biotechnology Co., Ltd	JY96-IIN
Centrífuga	Hitachi Koki Co., Ltd	CT15RE
Geladeira	Aucma Co., Ltd	DW-86L500
FastRNA Pro Green Kit	MP Biomédicos	#6045-050
Instrumento FastPrep-24	MP Biomédicos	116005500
Instrumento para PCR	SensoQuest GmbH	1124310110
QuantStudio 6 Flex	Thermo Fisher Scientific	4485689
SYBR Premix Ex Taq II	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR820A
Kit de reagentes PrimeScript RT com borracha de gDNA	Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd	RR047A