Quantificação da Eliminação Bacteriana para Avaliar o Potencial de Transmissão de Infecção em Drosophila

Resumo

Fonte: Siva-Jothy, J. A., et al., Infecção Bacteriana Oral e Eliminação em Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra o procedimento para monitorar a eliminação bacteriana em Drosophila , transferindo uma mosca infectada por vários tubos contendo alimentos, recuperando bactérias soltadas e quantificando colônias viáveis por diluição e placagem em série.

Protocolo

1. Medir a Eliminação Bacteriana
   1. Meça a queda junto com a carga interna.
   2. Após a infecção, transfira moscas individuais para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo ~50 μL de meio Lewis por 24 horas.
   3. Remova as moscas para a medição da carga interna e lave os tubos com 100 μL de 1x PBS (soro tampado com fosfato) vórtice intensamente por 3 segundos.
   4. Meça as CFUs (unidades formadoras de colônias) nessa lavagem por meio de placas em ágar nutritivo LB (Luria-Bertani).
   5. Após a infecção, transfira moscas individuais para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL contendo ~50 μL de meio Lewis por 24 horas.
   6. Transfira as moscas para novos tubos de microcentrífuga contendo ~50 μL de meio Lewis por mais 24 horas. Lave os tubos contaminados com 100 μL de 1x PBS fazendo vórtice intenso por 3 segundos.
   7. Meça as CFUs nessa lavagem aplicando o placar em ágar nutritivo LB.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Frascos	Sarstedt Ltd.	58.49	Tubo de base plano de poliestireno 75mm x 23,5mm, 23ml
Agar	Sigma-Aldrich	A7002	Ágar, cinzas 2,0-4,5%
Açúcar mascavo	Bidvest	66032	Açúcar mascavo e macio claro
Milho	Fazenda Dove's		Farinha de milho orgânica
Levedura de fermípico	Bidvest	96360	Levedura seca e instantânea
Placas de Petri	Fisher Scientific UK Ltd.	15788517	Placa de Petri X600 90 x 16,2MM Ventilação Tripla Estéril
Tubo Eppendorf (1,5ml)	Sarstedt Ltd.	72.690.001	Tampa de empurrador Sarstedt Micro Tube Cônica 1,5ml Neutro Padrão
Etanol	VWR International Ltd.	20821.33	ETANOL ABSOLUTO ANALAR NP ACS/R.PE - Grau Analítico
Caldo LB, Miller	Fisher Scientific UK Ltd.	BP1426	Contém 10g de triptona, 5g de extrato de levedura, 10g de cloreto de sódio por litro
Microplaca de 96 poços	Suprimentos de Laboratório Científico Ltd.	353072	Microplaca de cultura celular de poliestireno tratado com TC e fundo bem transparente, com tampa, estéril
Vórtice	Fisherbrand		Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Pontas de pipeta de 10 μL	Greiner Bio-one Inc	741015	Fácil de carregar no estilo Gilson. Graduado, limpo, recarregado, 960 peças
Pontas de pipeta de 200 μL	Greiner Bio-one Inc	741065	Fácil de carregar no estilo Gilson. Graduado, limpo, recarregado, 960 peças
Pontas de pipeta de 1000 μL	Greiner Bio-one Inc	741045	Fácil de carregar no estilo Gilson. Graduado, limpo, recarregado, 960 peças
Pontas de pipeta filtradas de 20 μL	Greiner Bio-one Inc	774288	Ponta de filtro estilo Gilson. Transparente, rack blue, pacote simples, sem R/Dnase, 10 racks de 96 peças
Pontas de pipeta filtradas de 200 μL	Greiner Bio-one Inc	739288	Ponta de filtro estilo Gilson. Transparente, rack blue, pacote simples, sem R/Dnase, 10 racks de 96 peças
Pontas de pipeta filtradas de 1000 μL	Greiner Bio-one Inc	740288	Ponta de filtro estilo Gilson. Transparente, rack blue, pacote simples, sem R/Dnase, 10 racks de 60 peças