Administração em Aerossol de Mycobacterium tuberculosis para infecção pulmonar em um modelo de camundongo

Resumo

Fonte: Mueller, A., et al. Um modelo experimental para estudar a coinfecção tuberculose-malária na transmissão natural de Mycobacterium tuberculosis e Plasmodium berghei. J. Vis. Exp. (2014)

Este vídeo demonstra a entrega em aerossol de Mycobacterium tuberculosis (Mtb) a camundongos usando um sistema de câmara baseado em nebulizador para induzir infecção pulmonar, fornecendo um modelo controlado e reprodutível para estudar a transmissão aérea da tuberculose e as interações hospedeiro-patógeno in vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Infecção por Aerossol em Camundongos com Mtb usando uma câmara de aerossol Glas-Col

A melhor forma de padronizar a infecção por aerossóis em animais experimentais com Mtb (Mycobacterium tuberculosis) é usar micobactérias de estoques congelados com títulos conhecidos de CFU (unidades formadoras de colônia). Para preparar culturas de estoque, cultivam Mtb em caldo Middlebrook 7H9 suplementado com meio de enriquecimento OADC (ácido oleico, albumina, dextrose, Catalase) e 0,05% Tween 80, uma fonte de carbono para micobactérias, e medidas para evitar aglomerações bacterianas são tomadas ao mesmo tempo. As culturas devem ter um OD (densidade óptica) ≤ 1 no momento da colheita. Em níveis mais altos de overdose, a formação bacteriana aumenta e a viabilidade diminui. Armazene 1 ml de alíquotas a -80 °C. Determine o número de UFC viáveis em estoques congelados colocando uma série de diluições 10 vezes de três frascos independentes em placas de ágar 7H11 suplementadas com 0,5% de glicerol, 1 g/L de asparagina e OADC, e enumere as colônias após 4 semanas de incubação a 37 °C. Realize infecção por aerossol conforme descrito abaixo.

1. Descongele estoques de MTB com título conhecido de CFU e misture cuidadosamente a suspensão cinco vezes para dispersar aglomerados bacterianos usando uma seringa de 1 ml equipada com agulha de 27 G. Evite a produção de aerossóis.
2. Dependendo da dose desejada para a infecção, transfira o volume necessário do estoque micobacteriano para um tubo de 50 ml contendo soro salino estéril tamponado com fosfato (PBS). O volume final tem 6 ml.

NOTA: Ao variar o número de microrganismos nesta suspensão, a proporção de bactérias portadoras de gotículas em aerossol é variada. Normalmente, buscamos captar 100 bacilos viáveis por pulmão (infecção em baixa dose). Em nossa experiência, isso requer cerca de 1-2 × 10⁶ Mtb/ml em um volume total de 6 ml, dos quais 5,5 ml são nebulizados. Recomenda-se realizar uma série de desafios experimentais em aerossol com diferentes concentrações de bactérias para encontrar as condições ideais para sua infecção. Enquanto infecções em altas doses com até 5.000 micobactérias podem ser feitas para acelerar o processo infeccioso, apenas 5 bactérias podem ser usadas para infectar camundongos com sucesso por aerossol. A taxa de infecção geralmente é de 100%.

3. Remover volume suficiente (preparado acima do volume final necessário) para o revestimento e determinar o título do inoculo; Normalmente removemos 500 μl para placar triplicados técnicos.
4. Coloque os animais em uma cesta de malha compartimentada (um camundongo por cesta) dentro da câmara circular de aerossol e feche a tampa da câmara de aerossol.

NOTA: Outros modelos são equipados com uma cesta em formato de torta composta por cinco compartimentos individuais, cada um com capacidade para 20 ratos.

5. Conecte a unidade nebulizadora Venturi às três juntas de soquete de aço inoxidável.
6. Remova a suspensão micobacteriana do tubo de 50 ml com uma seringa de 10 ml equipada com uma agulha romba de 18 g e leve a seringa para a câmara de aerossol em uma caixa de transporte fechada.
7. Remova a tampa do rosca da unidade nebulizadora e injete cuidadosamente a suspensão de micobactérias no nebulizador. Evite a geração de aerossóis. Descarte a seringa em um recipiente para objetos cortantes contendo 2% de Buraton. Sele o nebulizador com a tampa de rosca.
8. Ligue o interruptor principal e a lâmpada UV. O display no teclado de controle mostra "Glas-Col Apparatus Co".
9. Ligue o interruptor do programa. O display mostrará "O nebulizador está pronto?" "O cesto está carregado?" Pressione enter quando estiver pronto". Aperte enter.
10. A tela mostra "Enter Preheat Time 900"; Isso significa que o tempo de pré-aquecimento do incinerador (que descontamina o ar de exaustão) é de 900 segundos. Pressione Enter.
11. O display mostrará "Enter Nebulizing time 1.800"; Isso significa que o tempo de nebulização é definido para 1.800 segundos como padrão. Para estender o tempo de nebulização, insira "2.400" e pressione enter.

NOTA: Durante o ciclo de nebulização, o ar sob pressão atomiza a suspensão, gerando assim pequenas gotículas de aerossol contendo micobactérias. Com o fluxo principal de ar, essas gotículas (aproximadamente 2-5 μm de tamanho) são levadas para a câmara de aerossol.

 

12. O display mostrará "Enter C.D. Time 1.800"; Isso significa que o ciclo de decaimento leva 1.800 segundos. Defina para "2.400" e pressione Enter.

NOTA: Durante esse ciclo, a nuvem acumulada na câmara de aerossóis durante o ciclo de nebulização pode decair. As pequenas gotículas são inaladas pelos animais experimentais.

13. O display mostrará "Enter Dec Time 900"; isso significa que o ciclo de descontaminação da luz UV levará 900 segundos. Pressione enter. A máquina começa a passar por pré-aquecimento, nebulização, decomposição das nuvens e descontaminação por UV.
    ATENÇÃO: O medidor de vazão deve indicar 60 pés cúbicos/hora (verifique quando o ciclo de pré-aquecimento começa; ajuste a válvula de controle de vácuo se necessário) e o medidor de fluxo de ar comprimido 10 pés cúbicos/hora (verifique quando o ciclo de nebulização começa; ajuste a válvula de controle de ar de acordo).
14. Quando o ciclo terminar, o teclado mostrará "Processo Concluído – Remover Amostra". Desligue o programa, o UV e o interruptor principal de energia.
15. Verifique se a suspensão micobacteriana foi completamente nebulizada e, se não, registre o volume restante removendo cuidadosamente a suspensão com uma seringa apropriada equipada com uma agulha romba de 18 G. O volume restante não deve ultrapassar 1 ml.
16. Remova o nebulizador das juntas e coloque-o em uma panela contendo Buraton a 2% por pelo menos 2 horas; geralmente a desinfecção é feita O/N. Depois, transfira o nebulizador para uma panela nova e enxágue bem com água. Deixe o nebulizador secar ao ar.
17. Abra a câmara de aerossol e devolva os animais às gaiolas. Embale as cestas com sacos de autoclave e autoclave. Limpe as superfícies internas da câmara de aerossol com Buraton a 2%.

NOTA: Por razões de segurança, um respirador purificador de ar motorizado deve ser usado durante este procedimento.

18. Utilizando os 500 μl restantes da suspensão micobacteriana (ver passo 1.3), placar diluições 10 vezes de um triplicado técnico (3 x 100 μl) em placas de ágar 7H11.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Buraton	Schülke		Ingredientes ativos: aldeídos (formaldeído, glutaraldeído, oxalaldeído, etil hexanal)
Middlebrook 7H9	Sigma	M0178	Para culturas de caldo de MTB
Middlebrook 7H11	BD em Biociências	283810	Meio de ágar para cultura Mtb
Meio de enriquecimento OADC Middlebrook	BD em Biociências	212240	Adicione ao 7H9 e 7H11 para a cultura de MTB
Sistema de Exposição à Inalação	Glas-Col
Nebulizador-Venturi	Glas-Col