Desenvolvimento de um modelo de camundongo para infecção crônica de feridas cutâneas por Pseudomonas aeruginosa

Resumo

Fonte: de Vries, C. R., et.al. Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica da ferida por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a inoculação tardia de Pseudomonas aeruginosa luminescente em um camundongo com duas feridas dorsais de espessura total cobertas por um curativo transparente. Isso facilita a formação de biofilmes e o estabelecimento de infecções crônicas. O monitoramento regular da bioluminescência permite quantificar a carga bacteriana e acompanhar a progressão da infecção ao longo do tempo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Inoculação com Pseudomonas aeruginosa

1. Diluir a cultura PAO1:lux durante a noite até OD₆₀₀ = 0,05 em 75 mL de meio de caldo de lisogênia (LB) contendo 100 μg/mL de carbenicilina e aumentar a bactéria até que a cultura entre em fase exponencial inicial (OD₆₀₀≈0,3). Isso deve levar aproximadamente 2 a 3 horas.
2. Diluir PAO1:lux em soro salino tamponado com fosfato (PBS) até uma concentração de (7,5 ± 2,5) x 10² CFU/mL. Certifique-se de preparar o excesso de inóculo para garantir volume suficiente e permitir a formação após o experimento. Se for transportado entre instalações, use contenção dupla em uma caixa à prova de vazamentos claramente marcada como Biohazard.
3. Realize todo o trabalho com P. aeruginosa e camundongos usando equipamentos de proteção individual aprovados em um gabinete de segurança biológica (BSC) aprovado pelo Nível de Biossegurança Animal 2 (ABSL-2). Equipamentos reutilizáveis, como a balança, devem ser cobertos com filme plástico para evitar contaminação.
4. Anestesie o rato usando isoflurano a 3%. Pese o mouse e registre o peso. Injete o camundongo subcutâneamente com cloreto de sódio estéril pré-aquecido, 250 μL em cada flanco, totalizando 500 μL.
5. Se o revestimento transparente do rato se soltou durante a noite, remova cuidadosamente qualquer crosta e apresente um novo curativo.
6. Use uma seringa de 500 μL com tampa de segurança tuberculina 27 G para injetar 40 μL da suspensão PAO1:lux através do curativo transparente em cada ferida. Diferentes camundongos devem ser usados para controles de feridas não inoculados/PBS para evitar contaminação cruzada pelo lado contralateral.
7. Coloque o rato de volta na gaiola, em uma bolsa térmica e monitore até acordar. Todos os camundongos devem ser mantidos individualmente em gaiolas separadas para evitar contaminação cruzada.
8. Forneça uma pasta nutricional com alto teor calórico entre os pellets de comida no chão da gaiola.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Injeção de cloreto de sódio a 0,9%	Hospira	2484457
C57BL/6J camundongos machos	O Laboratório Jackson	664
Soro Tamponado com Fosfato (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Prensagem e Selagem Aderente	Que bom	N/A
Seringa de insulina Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Escala	Ohaus Scout Pro	SP202
Suplemento Nutricional Suplical	Henry Schein Saúde Animal	29908