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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.
1. Inoculação com Pseudomonas aeruginosa
- Diluir a cultura PAO1:lux durante a noite até OD600 = 0,05 em 75 mL de meio de caldo de lisogênia (LB) contendo 100 μg/mL de carbenicilina e aumentar a bactéria até que a cultura entre em fase exponencial inicial (OD600≈0,3). Isso deve levar aproximadamente 2 a 3 horas.
- Diluir PAO1:lux em soro salino tamponado com fosfato (PBS) até uma concentração de (7,5 ± 2,5) x 102 CFU/mL. Certifique-se de preparar o excesso de inóculo para garantir volume suficiente e permitir a formação após o experimento. Se for transportado entre instalações, use contenção dupla em uma caixa à prova de vazamentos claramente marcada como Biohazard.
- Realize todo o trabalho com P. aeruginosa e camundongos usando equipamentos de proteção individual aprovados em um gabinete de segurança biológica (BSC) aprovado pelo Nível de Biossegurança Animal 2 (ABSL-2). Equipamentos reutilizáveis, como a balança, devem ser cobertos com filme plástico para evitar contaminação.
- Anestesie o rato usando isoflurano a 3%. Pese o mouse e registre o peso. Injete o camundongo subcutâneamente com cloreto de sódio estéril pré-aquecido, 250 μL em cada flanco, totalizando 500 μL.
- Se o revestimento transparente do rato se soltou durante a noite, remova cuidadosamente qualquer crosta e apresente um novo curativo.
- Use uma seringa de 500 μL com tampa de segurança tuberculina 27 G para injetar 40 μL da suspensão PAO1:lux através do curativo transparente em cada ferida. Diferentes camundongos devem ser usados para controles de feridas não inoculados/PBS para evitar contaminação cruzada pelo lado contralateral.
- Coloque o rato de volta na gaiola, em uma bolsa térmica e monitore até acordar. Todos os camundongos devem ser mantidos individualmente em gaiolas separadas para evitar contaminação cruzada.
- Forneça uma pasta nutricional com alto teor calórico entre os pellets de comida no chão da gaiola.