Imagem por Bioluminescência de Infecções Bacterianas em Camundongos

Resumo

Fonte: de Vries, C. R., et al., Um modelo de inoculação retardada da infecção crônica de feridas por Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020).

Este vídeo demonstra uma técnica de imagem bioluminescente para monitorar a progressão da infecção bacteriana em um modelo de camundongos vivo. Bactérias patogênicas modificadas com o sistema repórter luxABCDE emitem luz no local da infecção, permitindo a visualização de bactérias metabolicamente ativas. Ao imagear o camundongo ao longo do tempo, os pesquisadores podem acompanhar de forma não invasiva a dinâmica da infecção e quantificar a intensidade do sinal bioluminescente.

Protocolo

1. Preparação e crescimento de bactérias

1. Realizar todo o trabalho com P. aeruginosa e animais com precauções BSL-2, conforme as diretrizes do comitê institucional de biossegurança e do comitê de uso animal do pesquisador. Realize todas as etapas descritas aqui envolvendo P. aeruginosa, incluindo inoculação de camundongos, em um gabinete de biossegurança.
2. A cepa luminescente PAO1:lux de P. aeruginosa está disponível em nosso laboratório mediante solicitação. Streak PAO1, armazenado como estoque congelado de glicerol, no ágar de Caldo de Lisogênia (LB). Para a cepa luminescente PAO1:lux, o ágar LB deve conter antibióticos seletivos (100 μg/mL de carbenicilina e 12,5 μg/mL de kanamicina). Cultive a 37 °C durante a noite em uma incubadora bacteriana.
3. Escolha uma colônia isolada e cultive durante a noite a 37 °C em 3 ml LB de meio, pH 7,4. Para cepas luminescentes, o caldo deve conter 100 μg/mL de carbenicilina. Cresce sob condições de tremor e aeróbicas.

2. Preparação do procedimento

1. Faça com que todo o pessoal que realiza a cirurgia use um avental limpo/jaleco, máscara facial, rede de cabelo e luvas.
2. Autoclave para todas as ferramentas cirúrgicas, incluindo tesouras e pinças. Use técnicas assépticas para esterilizar ferramentas entre animais.
3. Limpe a mesa cirúrgica com etanol e prepare um campo cirúrgico limpo.

3. Depilação

1. Anestesiar camundongos C57BL/6J de 8 a 12 semanas usando isoflurano de 1% a 3%. Os pesquisadores devem seguir as orientações da equipe veterinária da instituição para anestesia ao usar isoflurano.
   1. Comece a anestesia administrando isoflurano de 1%–3% e ajuste a taxa de fluxo de oxigênio para 1,5 L/min. Coloque o rato na câmara de indução.
   2. Belisca o dedo do pé do rato para avaliar a profundidade da anestesia. Quando o camundongo não responder mais à estimulação, retire-o da câmara de indução e coloque-o na bancada cirúrgica com o nariz no cone nasal de isoflurano.
   3. Aplique lubrificante ocular em ambos os olhos.
2. Pese o rato para obter um peso base pré-procedimento.
3. Coloque o rato em posição deitada. Injete o camundongo subcutâneamente com cloreto de sódio estéril pré-aquecido, 250 μL em cada flanco, totalizando 500 μL.
4. Raspe a área dorsal do rato usando uma máquina de barbear elétrica. A barba deve ser feita em um local diferente da estação cirúrgica para evitar contaminação pelos da ferida.
5. Aplique uma camada fina de loção depilante. Deixe o creme agir por 20 a 60 segundos. Remova o cabelo e o excesso de loção com gaze umedecida em água morna. Após a remoção de pelos, prossiga com o procedimento de ferida por excisão.

4. Cirurgia de ferida excisional em espessura total

1. Injetar buprenorfina de liberação prolongada 0,6–1 mg/kg subcutâneamente usando uma agulha de 25 G na região dorsal média do camundongo. A buprenorfina de liberação lenta proporciona alívio da dor ao longo de 48–72 horas.
2. Desinfete o local cirúrgico. Limpe a superfície dorsal com um cotonete estéril de betadina. Limpe o excesso de Betadine com um cotonete álcool estéril. Isso deve ser feito 3 vezes (alternando entre betadine e álcool), fazendo swabing movendo-se do centro em círculo até a borda. Deixe a área secar ao ar.
3. Crie uma cortina ao redor do local cirúrgico usando gaze estéril ou filme plástico.
4. Estique a pele de forma caudal. Use um punção de biópsia cutânea estéril de 6 mm de diâmetro para fazer uma incisão inicial na epiderme dorsal esquerda. Repita na epiderme dorsal direita.
5. Use pinças para atenuar a pele a partir do centro da área da ferida delineada à esquerda. Retire as camadas epidérmica e dérmica usando tesoura. Repita na área da ferida delineada à direita para criar feridas excisionais simétricas.
6. Lave as feridas com 50 μL de soro fisiológico estéril. Deixe o local cirúrgico e a pele ao redor secarem ao ar. Depois, cubra as feridas e o dorso com um curativo transparente.
7. Coloque o rato de volta em uma gaiola limpa. Uma casa de 1 animal por gaiola.
8. Coloque a gaiola em uma almofada térmica e monitore até o rato acordar.
9. Ao realizar a cirurgia acima em vários animais, use um esterilizador de esferas quentes para limpar todos os instrumentos cirúrgicos entre os animais.
10. Deixe-se 24 horas para que os camundongos se recuperem do procedimento cirúrgico e para a formação de uma matriz provisória de feridas sobre as feridas antes de prosseguir para a inoculação com bactérias.

5. Inoculação com P. aeruginosa

1. Diluir a cultura PAO1:lux durante a noite até OD600 = 0,05 em 75 mL de meio LB contendo 100 μg/mL de carbenicilina e aumentar a bactéria até que a cultura esteja na fase exponencial inicial (OD₆₀₀ ≈ 0,3). Isso deve levar aproximadamente 2 a 3 horas.
2. Diluir PAO1: lux em PBS até uma concentração de (7,5 ± 2,5) x 10² CFU/mL. Certifique-se de preparar o excesso de inóculo para garantir volume suficiente e permitir a formação após o experimento. Se for transportado entre instalações (ou seja, do laboratório ao vivário), use dupla contenção em uma caixa à prova de vazamentos claramente marcada como Biohazard.
3. Realize todo o trabalho com P. aeruginosa e camundongos usando equipamentos de proteção individual aprovados em um gabinete de segurança biológica (BSC) aprovado pelo Nível de Biossegurança Animal 2 (ABSL-2). Equipamentos reutilizáveis, como a balança, devem ser cobertos com filme plástico para evitar contaminação.
4. Anestesie usando isoflurano a 3%, conforme descrito acima. Pese o mouse e registre o peso. Injete o camundongo subcutâneamente com cloreto de sódio estéril pré-aquecido, 250 μL em cada flanco, totalizando 500 μL.
5. Se o revestimento transparente do rato se soltou durante a noite, remova cuidadosamente qualquer crosta e apresente um novo curativo.
6. Use uma seringa de 500 μL com tampa de segurança tuberculina 27 G para injetar 40 μL da suspensão PAO1:lux através do curativo transparente em cada ferida. Diferentes camundongos devem ser usados para controles de feridas não inoculados/PBS para evitar contaminação cruzada pelo lado contralateral.
7. Coloque o rato de volta na gaiola, em uma bolsa térmica e monitore até acordar. Todos os camundongos devem ser mantidos individualmente em gaiolas separadas para evitar contaminação cruzada.
8. Forneça uma pasta nutricional de suplemento com alto teor calórico entre os pellets de comida no chão da gaiola.
9. Use o inóculo restante para riscar uma placa de ágar LB. Conte colônias para confirmar o número de bactérias administradas.

6. Imagem in vivo de feridas infectadas

1. Siga os protocolos de contenção BSL-2 para transporte de camundongos de e para o instrumento de imagem, incluindo o uso de um recipiente secundário. Tome cuidado para não transferir ou deixar cair qualquer cama de animal durante a transferência do camundongo para a câmara de indução ou instrumento de imagem.
2. Induzir anestesia do camundongo com isoflurano inalado de 1% a 3% em uma câmara de indução.
3. Uma vez que o camundongo esteja anestesiado, coloque-o em posição prona na câmara de imagem de um sistema óptico de imagem, com o nariz no cone nasal de isoflurano.
4. Abra o programa do software.
5. Os parâmetros de aquisição variarão com base no número de animais fotografados simultaneamente e na intensidade da bioluminescência. Os parâmetros básicos a serem definidos incluem tempo de exposição, binning, f/stop e campo de visão (FOV). Nossas configurações padrão de início são tempo de exposição 30 segundos, binning low (2), f/stop 1.2 e FOV 25. Ajuste essas configurações conforme necessário, dependendo das necessidades do pesquisador.
6. Analise dados de luminescência usando um programa de imagem. A luminescência será representada como uma imagem pseudocolorida sobreposta a uma fotografia colorida dos camundongos.
   1. Crie uma região de interesse (ROI) no local da ferida e meça o fluxo médio (fótons/segundo) detectado. Note que os dados também podem ser reportados como radiância (fótons/segundo/cm²/esteradiano), mas enquanto a distância da plataforma de imagem à câmera permanecer constante entre as imagens, o fluxo é suficiente.
   2. Meça o fundo criando um retorno sobre a informação em uma área aleatória da plataforma de imagem. Subtraia o número de fótons de fundo por segundo.
   3. Exporte os dados para uma planilha para análise mais detalhada.
7. Realize imagens conforme descrito acima com frequência diária para acompanhar a progressão da infecção.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Injeção de cloreto de sódio a 0,9%	Hospira	2484457
18 G x 1 agulha estéril	BD	305195
25 G x 1 1/5 agulha estéril	BD	305127
Swab de álcool	BD	326895
Software de Imagem de Aura	Imagens de Instrumentos Espectrais	N/A
Betadine	Purdue Frederick Company	19-065534
LABORATÓRIO DE BUPRENORFINA SR	Zoopharm	N/A
C57BL/6J camundongos machos	O Laboratório Jackson	664
Punção descartável para biópsia, 6mm	Integra	33-36
Tesoura fina - Carboneto de Tungstênio	Ferramentas Científicas Finas	14568-09
Esterilizador de Vidro Seco com Contas de Vidro	Aparato de Harvard	61-0183
Ágar granulado	Biorreagentes Fisher	BP9744
Bolsa Térmica	Milliard	804879481218
Seringa de insulina com agulha de 28 G	BD	329461
Sistema de Imagem Lago X	Imagens de Instrumentos Espectrais	N/A
Caldo LB	Biorreagentes Fisher	BP1426
Seringa Leur-Lok 1 mL	BD	309628
Mini Arco Aparador de Animais	Wahl Professional	919152
Loção depilatória Nair com óleo para bebês	Church e Dwight	N/A	Disponível em qualquer farmácia
Pinças Octógonas	Ferramentas Científicas Finas	11041-08
Placa de Petri	Falcon	351029
Soro Tamponado com Fosfato (PBS) 1x	Corning	21-040-CV
Prensagem e Selagem Aderente	Que bom	N/A
Seringa de insulina SafetyGlide com agulha de 30 G	BD	305934
Seringa de insulina Safetyglide, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW	BD	305934
Escala	Ohaus Scout Pro	SP202
Suplemento Nutricional Suplical	Henry Schein Saúde Animal	29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm	3M	1624W