Ensaio de Co-Infiltração para Triagem de Efetores de Patógenos que Suprimem o Silêncio do RNA Vegetal

Resumo

Fonte: Shi, J., et al. Triagem e identificação de supressores silenciadores de RNA a partir de efetores secretados de patógenos vegetais. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra um ensaio de coinfiltração para identificar proteínas efetoras de patógenos que suprimem o silenciamento de RNA na Nicotiana benthamiana 16c. Um repórter fluorescente e um gene efetor candidato são entregues às folhas da planta via Agrobacterium. Normalmente, o silenciamento de RNA degrada os transcritos repórteres, reduzindo a fluorescência. Efetores supressores bloqueiam essa resposta, preservando a fluorescência. Este ensaio oferece um método rápido e visual para triar efetores microbianos que interferem na defesa do hospedeiro.

Protocolo

Coinfiltração Nicotiana benthamiana folhas

1. Misture volumes iguais de uma cultura de Agrobacterium contendo 35S-GFP com uma cultura de Agrobacterium contendo 35S-supressor do vírus mosaico do pepino 2b (CMV2b), efetor putativo ou vetor vazio (EV).
2. Infiltre-se cuidadosamente e lentamente nas suspensões mistas de agrobacterium nos lados abaxiais das folhas de N. benthamiana 16c usando uma seringa sem agulha de 1 mL.
3. Remova a suspensão bacteriana restante das folhas com limpadores de tecido mole e circule as margens das manchas infiltradas com um caneta de fabricação.
4. Deixe as plantas infiltradas na câmara de crescimento sob as mesmas condições de crescimento.
   
   NOTA: Por razões de segurança e saúde, óculos protetores e máscara devem ser usados durante a infiltração. Para evitar contaminação cruzada, as luvas devem ser trocadas ou esterilizadas com etanol entre as infiltrações. Normalmente, pelo menos 1 mL de suspensões de agrobactéria por folha são necessários para a infiltração. Para o silenciamento sistêmico, serão necessárias pelo menos duas folhas para a infiltração.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lâmpada UV	Analytik Jena	UVP B-100AP	Observação