Isolamento de Bactérias do Intestino Médio do Mosquito

Resumo

Fonte: Liu, X., et al. Um ensaio de alimentação oral bacteriana com mosquitos tratados com antibióticos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a dissecação do intestino médio do mosquito para isolar bactérias intestinais. O intestino médio é extraído do trato digestivo, homogeneizado para liberar as bactérias e colocado em ágar nutritivo para cultivar colônias bacterianas.

Protocolo

1. Dissecar o intestino médio do mosquito
   1. Transfira o mosquito esterilizado na superfície para a lâmina de vidro com uma gota de soro salino 1x tamponado com fosfato (PBS) estéril. Dissecar sob o microscópio dissecante.
   2. Sob a ampliação inferior do microscópio dissecador, remova cuidadosamente as pernas, asas e cabeça do mosquito para evitar fugas. Remova o último somite do mosquito cortando diretamente, em vez de puxando, para evitar que o trato digestivo se quebre.
   3. Prenda o tórax do mosquito e a extremidade do abdômen com uma pinça. Puxe suavemente o trato digestivo do mosquito. O trato digestivo adquirido geralmente contém a cultura, o intestino anterior, o intestino médio, o intestino posterior e os tubos de Malpighi.
   4. Ajuste o microscópio dissecante para uma ampliação maior. Remova a cultura, o intestino anterior, o intestino posterior e os tubos de Malpighi do trato digestivo dissecado para obter o intestino médio do mosquito.
   5. Tenha cuidado ao remover a cultura, pois a cultura infla e se assemelha ao intestino médio depois que o mosquito toma uma farinha de açúcar. Os tubos de Malpighi, um grupo de tubos excretores longos e finos, estão localizados na fronteira entre o intestino médio e o intestino posterior.
2. Isolar bactérias intestinais
   1. Transfira o intestino médio dissecado para um tubo estéril de 1,5 mL com 200 μL de buffer estéril 1x PBS.
   2. Moa o intestino médio em uma bancada estéril cuidadosamente com um pilão estéril para permitir a liberação completa das bactérias intestinais para o tampão.
   3. Diluir em série o homogeneado em três diluições de 10 vezes. Adicione 50 μL de cada diluição à placa de ágar LB (caldo Luria) e espalhe sobre a placa. Se o intestino médio contiver uma alta concentração de flora intestinal, é essencial fazer mais diluições seriadas para identificar colônias individuais.
   4. Incube a placa a 37 °C por 1–2 dias até que colônias individuais fiquem visíveis.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Aedes aegypti			Mosquitos fêmeas
Tubo centrífuga	Sangon Biotech	F601620-0010	1,5 mL, natural, graduado, estéril
Pilão descartável para moer tecidos	Sangon Biotech	F619072-0001	70 mm de comprimento, cônica, azul, estéril
Pinças	RWD	F11029	Dissecação
Pó de ágar LB	Sangon Biotech	A507003	Triptona 10,0 g, Extrato de Levedura 5,0 g, NaCl 10,0 g, Ágar 15,0 g.
Microscópio	Zeiss	Stemi508
Buffer PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Esse produto é uma solução 10X. Por favor, dilua 10 vezes antes de usar. O valor de pH é 7,4.