Estabelecimento de uma População Bacteriana Intestinal Definida em Mosquitos Adultos

Resumo

Fonte: Liu, X., et al. Um ensaio de alimentação oral bacteriana com mosquitos tratados com antibióticos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a diminuição da microbiota intestinal nativa em mosquitos usando uma solução contendo sacarose com antibiótico. Isso é seguido por uma recolonização controlada com uma suspensão bacteriana administrada por meio de um sistema de alimentação por membrana para estabelecer uma população bacteriana definida no intestino do mosquito.

Protocolo

1. Tratamento com antibióticos e reintrodução de bactérias

1. Prepare a solução antibiótica.
   1. Pese a quantidade necessária de sacarose, penicilina e estreptomicina para preparar uma solução de sacarose a 10% incluindo 20 unidades de penicilina e 20 μg de estreptomicina por mL.
2. Alimente os mosquitos com a solução antibiótica.
   1. Anestesie os mosquitos a 4 °C por 3–5 minutos. Transfira os mosquitos para um copo de papel. Cubra a parte de cima com gaze e envolva a gaze com fita adesiva para evitar que os mosquitos escapem.
   2. Mergulhe bolas de algodão estéreis na solução antibiótica e coloque-as cuidadosamente sobre o copo antimosquito. Esprema as bolas de algodão antes de usar para evitar que mosquitos se afogem nas bolinhas de algodão pingando.
   3. Cubra os algodões com uma placa de Petri de 10 cm para evitar a evaporação da umidade. Troque os algodões duas vezes ao dia por três dias consecutivos.
3. Preparação de suspensão bacteriana
4. Meça a solução bacteriana com um espectrofotômetro. Adicione 1 suspensão bacteriana OD (OD₆₀₀) em um tubo de 1 mL. Centrifuge a suspensão a 5.000 x g por 5 minutos a 4 °C.
5. Descarte o sobrenadante e adicione 1 mL de buffer estéril 1x PBS a um tubo de 1,5 mL para a precipitação em suspensão.
6. Centrifugar a 5.000 x g por 5 minutos a 4 °C; Descarte o sobrenadante.
7. Repita os passos 2.4.2 e 2.4.3.
8. Adicione 200 μL de soro tampão estéril 1x tamponado com fosfato (PBS) à precipitação bacteriana.
9. Adicione 600 μL de solução de sacarose a 10%, 200 μL de 10 mm de adenosina 5′-trifosfato (ATP), que atua como fagoestimulante, e 200 μL de suspensão bacteriana em um tubo estéril de 1,5 mL. Misture por vortex.
10. Alimente o mosquito com a suspensão bacteriana.
    1. Deixe os mosquitos de fome por 24 horas, permitindo que os antibióticos sejam metabolizados antes de alimentar as bactérias.
    2. Montar o sistema de alimentação por membrana.
    3. Sele a unidade alimentadora esterilizada com parafilme ou, alternativamente, uma membrana de colágeno.
    4. Coloque um anel de plástico e fixe com parafilm para evitar quebrar devido ao atrito durante a alimentação.
    5. Adicione lentamente a solução bacteriana preparada à unidade alimentadora.
       Nota: Apenas um poço da unidade alimentadora de dois poços pode ser preenchido com a solução, cobrindo a unidade alimentadora apenas pelo lado do refluxo de reagentes.
    6. Conecte a unidade alimentadora a um sistema de alimentação pré-aquecido a 37 °C, que simula a temperatura humana para atrair mosquitos. Coloque o dispositivo de alimentação em um copo de papel cheio de mosquitos e alimente por 90 minutos.
    7. Após a alimentação, anestesie os mosquitos submetendo-os a uma temperatura de 4 °C por 3–5 minutos e mantenha-os anestesiados em uma placa de Petri gelada.
    8. Escolha os mosquitos totalmente inchados para estudos adicionais.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Hidrato de sal dissódico 5′-trifosfato	Sigma	A2383	O hidrato de sal dissódico de adenosina 5′-trifosfato tem sido usado para preparar soluções padrão de adenosina trifosfato (ATP)
Sistema de alimentação por membrana Hemotek	Hemotek		Componentes do sistema de alimentação, incluindo controlador de temperatura Hemotek, conjunto de carcaça do alimentador, alimentador metálico montados.
Parafilm	Sangon Biotech	F104002	4 pol x 125 pés
Placa de Petri	Sangon Biotech	F611203
Penicilina G, sal de procaína hidratado	Sangon Biotech	A606248	Pó branco. Solúvel em água, solúvel em metanol, levemente solúvel em água, etanol
Sulfato de estreptomicina	Sangon Biotech	A610494	O sulfato de estreptomicina é um antibiótico de glucosamina que interfere na síntese de proteínas procarióticas.
Sacarose	Sangon Biotech	A502792	Soluvel em água, etanol e metanol, ligeiramente solúvel em glicerol e piridina.
Buffer PBS 10X	Sangon Biotech	E607016	Esse produto é uma solução 10X. Por favor, dilua 10 vezes antes de usar. O valor de pH é 7,4.