Imagens ao vivo da morte celular de macrófagos durante infecção por micobactérias em embriões de peixe-zebra

Resumo

Fonte: Niu, L., et al. Visualização da morte celular lítica de macrófagos durante infecção por micobactérias em embriões de peixe-zebra via microscopia intravital. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o uso da microscopia confocal intravital para visualizar a morte celular lítica de macrófagos em embriões de peixe-zebra após infecção por Mycobacterium marinum .

Protocolo

1. Imagem ao vivo da infecção

1. 1. Montagem de peixes para imagem em tempo real
   1. Transfira até 10 embriões anestesiados com tricaína para o centro de um recipiente de 35 mm com fundo de vidro. Descarte o médio extra da E3.
   2. Cubra o recipiente com 1% de agarose com ponto de fusão baixo e oriente cuidadosamente os embriões de peixe-zebra usando uma agulha de 10 G. Incube a taça de vidro no fundo do fundo no gelo por 10 segundos para solidificar a agarose.
      NOTA: Para a injeção do mesencéfalo, os embriões devem ser montados na agarose com a cabeça voltada para cima (Figura 1A).
   3. Quando estiver completamente solidificado, cubra a agarose com uma camada de água de ovo (mais 1 x tricaína e PTU (N-feniltiorreia)).
2. Microscopia confocal de alta resolução e lapso de tempo em três cores
   NOTA: Os passos a seguir são operados em uma microscopia confocal equipada com uma lente objetiva UV de óleo 63,0x 1,40.
   1. Ajuste a temperatura da câmara ambiental para 28,5 °C. Coloque um pouco de papel de seda úmido dentro da câmara para fornecer umidade e evitar a evaporação da água do ovo.
   2. Coloque o prato de vidro de 35 mm com o peixe-zebra na câmara ambiental.
   3. Abra o software confocal e inicialize o estágio. Mude para a objetiva UV de óleo 63,0 x 1,40 e localize o peixe-zebra usando o canal de campo claro com um filtro de contraste de interferência diferencial (DIC).
   4. Abra o Diodo de 405, Argônio (20% de potência) e o laser DPSS de 561 nm. Configure a potência e as configurações de espectro do laser apropriadas.
      NOTA: A seguir estão as configurações de espectro para Cerúleo (excitação = 405 nm; emissão = ~456–499 nm), eGFP (excitação = 488 nm; emissão = ~500–550 nm), DsRed2 (excitação = 561 nm; emissão = ~575–645 nm)
   5. Escolha o modo de aquisição "XYZ" e "Varredura Sequencial" e defina o formato da imagem para "512 x 512 pixels".
   6. Mude para o "Modo Dados ao Vivo". Mire na posição do primeiro peixe-zebra e marque a posição "Início" e "Fim" em Z. Repita esse processo para cada um dos embriões restantes. Uma "Pausa" pode ser adicionada ao final do programa.
   7. Defina o ciclo e o loop do programa.
   8. Salve o arquivo.

Resultados

Figura 1: Montagem de embriões de peixe-zebra para imagens ao vivo. (A) Para infecção mesencéfala, embriões de peixe-zebra eram montados com a cabeça voltada para baixo. (B) Para a infecção na região ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Um prato de fundo de vidro de 35 mm	In Vitro Scientific	D35-10-0-N
Agarose	Sangon Biotech	A60015
Microscópio confocal	Leica	TCS SP5 II
Câmara Ambiental	Pecon	Controle de temperatura 37-2 digital
Mycobacterium marinum			ATCC BAA-535
N-feniltioureia (PTU)	Sigma	P7629