Avaliação In Vitro da Morte Bacteriana por Fagocitos Esplênicos de Camundongos Neonatais

Resumo

Fonte: Seman, B. G., et.al. Modelo de imagem neonatal da sepse bacteriana Gram-negativa. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o isolamento de neutrófilos e monócitos inflamatórios de baços de camundongos neonatais e sua aplicação em um ensaio luminescente que mata bactérias. Ele cobre dissociação mecânica, lise de glóbulos vermelhos, enriquecimento celular baseado em esferas magnéticas, incubação bacteriana e proteção antibiótica. Leituras de luminescência temporizadas indicam internalização inicial bacteriana seguida de eliminação mediada pelo sistema imunológico.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética animal apropriado.

1. Ensaio in vitro de eliminação bacteriana

1. Remova o baço de um filhote neonatal não infectado e coloque-o em uma cesta de nylon de 40 μm dentro de uma placa de Petri estéril de 60 mm. Repita isso e agrupe os baços em um único tubo para serem colhidos e homogeneizados juntos.
2. Adicione 5 mL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS).
3. Desagrega o tecido usando um êmbolo de seringa estéril de 3 mL até que uma suspensão de célula única seja criada.
4. Recolha a suspensão de célula única do lado de fora do cesto de nylon, transfira para um tubo de centrífuga de 15 mL e faça células de pellet a 350 x g por 5 minutos.
5. Suspenda as células em um tampão de lise de glóbulos vermelhos (2 mL para até 7-8 baços) e deixe repousar por 5 minutos em temperatura ambiente para eliminar eritrócitos.
6. Lave os esplenócitos com PBS e pellets como acima.
7. Suspenda os esplénócitos em 0,25 mL de PBS suplementado com 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA conforme o rendimento celular esperado.
8. Conte os esplénócitos usando um hemocitômetro ou outra aplicação apropriada.
9. Isolar células Ly6B.2⁺ (população mieloide de granulócitos/monócitos inflamatórios) com esferas imunomagnéticas.
10. Semente células Ly6B.2⁺ com uma densidade de 1 x 10⁵ células por poço em uma placa preta ou branca de 96 poços em um volume de 0,1 mL de DMEM que contenha 10% de FBS, 2 mM de glutamina e 25 mM de HEPES (meio completo).
11. Enumere E. coli bioluminescente e prepare o inóculo bacteriano na multiplicidade desejada de infecção (MOI) em um volume final de 0,1 mL. Isso é melhor feito fazendo o necessário para todos os poços em um MOI comum em lotes.
12. Adicione 0,1 mL de inóculo bacteriano ou meio completo apenas como controle. Incube a placa multipoço a 37 °C e 5% de_CO2 por 1 hora.
13. Substitua o meio por 0,2 mL de meio completo e fresco que contenha gentamicina (100 μg/mL) removendo suavemente o meio com uma pipeta e adicionando meio fresco com uma nova ponta de pipeta. Retorne a cultura à incubação por mais 2 horas.
14. Às 3 horas após a infecção, meça a luminescência em cada poço da placa de cultura com tampa a partir de baixo usando um leitor de placas e então retorne a cultura à incubação.
15. Repita as medições de luminescência em outros pontos de tempo desejados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Buffer de Lise ACK	Gibco	LSA1049201	Ensaio de eliminação bacteriana
Microesferas Anti-Ly-6B.2	Miltenyi Biotec	130-100-781	Isolamento celular
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expressa luciferase)	N/A	N/A	Construído internamente na WVU
Buffer de Isolamento	Miltenyi Biotec	N/A	Ensaio de eliminação bacteriana
LB Broth, Lennox	Biorreagentes Fisher	BP1427-500	Crescimento bacteriano
EASYstrainer (Cesta de Nylon)	Greiner Bio-one	542 040	Filtro de célula
SpectraMax iD3	Dispositivos Moleculares	N/A	Leitor de placas