Modelagem da Infecção em Camundongos Neonatais Usando Bactérias Bioluminescentes Encapsuladas

Resumo

Fonte: Seman, B. G., et al. Um modelo de imagem neonatal para sepse bacteriana gram-negativa. J. Vis. Exp. (2020)

O vídeo demonstra um modelo neonatal de camundongo para estudar infecção sistêmica usando bactérias bioluminescentes encapsuladas. Filhotes neonatais são injetados com suspensões bacterianas de alta ou baixa dose e retornados à mãe para cuidados pós-natais. As bactérias encapsuladas escapam da detecção imune precoce, se espalham sistêmicamente e são visualizadas ao longo do tempo por meio de imagens por luminescência. Esse modelo permite o acompanhamento não invasivo da progressão da infecção em camundongos neonatais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Preparação do Inóculo Bacteriano

1. Estrie uma placa de ágar de soja tríptica (TSA) com um laço inoculante para isolamento de uma única colônia de um estoque congelado de Escherichia coli O1:K1:H7-lux que expressa de forma estável a luciferase e carrega resistência à kanamicina. Incube durante a noite a 37 °C.
2. No dia seguinte, deixe o caldo Luria (LB) atingir a temperatura ambiente (25 °C) em um armário de biossegurança.
3. Sob um capuz de armário de biossegurança, identifique uma única colônia da placa riscada e inocule-a em 3 mL de LB suplementados com kanamicina (30 μg/mL). Incube durante a noite a 37 °C com agitação a 220 rotações por minuto (rpm). Essa é a cultura do iniciante.
4. Dilua a cultura inicial 1:100 em 3 mL frescos de LB sob um cofre de biossegurança e retorne à incubadora por 2-3 horas a 37 °C com agitação (220 rpm). Essa é a cultura do estoque.
5. Leia a densidade óptica (OD) tanto da cultura em branco quanto da cultura padrão a 600 nm usando um espectrofotômetro. Adicione 100 μL de LB (sem contendo bactérias) em um poço de uma placa de ensaio de fundo plano com 96 poços; Este é o espaço em branco. Depois, adicione 100 μL da cultura de origem para um poço separado. Repita para duas réplicas adicionais. A absorção é lida usando um leitor de placas.
6. Subtraia a absorvância em branco do valor de absorção da cultura de stock (o valor OD) e compare com uma curva de crescimento previamente gerada e validada para determinar uma aproximação da densidade bacteriana na cultura de stock para a preparação da dose infecciosa.
7. Gerar inóculos-alvo dependendo da pergunta de pesquisa. Inóculo alvo de 2 unidades formadoras de colônia (CFU) por camundongo (/camundongo) foram usados para este estudo.
   1. Divida a dose-alvo por camundongo (DoseT) pela concentração estimada de bactérias na cultura de stock (Stock) para obter o volume de bactérias necessário do tubo de stock (VS).
   2. Multiplique o VS pelo número de camundongos (NM) que precisam ser infectados, junto com o suficiente para 5-10 extras, para a quantidade total de bactérias necessária para a infecção, além de 5-10 doses adicionais. Remova esse volume do tubo original e adicione-o a um novo tubo de centrífuga.
   3. Use a equação abaixo: DoseT/Stock = VS x NM = volume total (VT) das bactérias a serem removidas do tubo original.
8. Centrifuge a bactéria a 2.000 x g por 5 minutos a 4 °C e ressuspenda o pellet bacteriano em 50 μL de soro salino tamponado com fosfato (PBS) (pH 7,2-7,6) por camundongo a ser infectado (por exemplo, para 10 doses de 2 bactérias 10⁶ a cada dose, o pellet de 2 bactérias 10⁷ será ressuspenso em 500 μL PBS). Novamente, recomenda-se preparar mais inóculo do que o necessário. Prepare um volume igual de PBS apenas para as inoculações de controle. Mantenha o controle do inóculo infeccioso e do PBS no gelo até a infecção.
9. Realize sete diluições seriadas dez vezes em PBS em uma placa de diluição plástica com fundo de 96 poços, e a placa de 25 μL das diluções em duplicado em placas TSA em quadrantes suplementadas com kanamicina (30 μg/mL) para enumerar a quantidade real de bactérias administradas. Incube a 37 °C durante a noite para formação da colônia antes da enumeração.

2. Identificação animal

1. Organize um número suficiente de casais reprodutores para que as ninhadas possam ser sincronizadas para filhotes com idades semelhantes. Variabilidade de idade de ± 1 dia é aceitável.
2. Identifique uma fêmea de camundongo C57BL/6 grávida e monitore o nascimento da ninhada antes do experimento planejado para determinar com precisão a idade.
3. Para distinguir entre filhotes controle e infectados de 3 ou 4 dias, use um par de tesouras pequenas de íris de ponta fina para cortar apenas as pontas das caudas dos filhotes controle. Os filhotes infectados não recebem cortes na cauda. Antes de cortar a cauda, desinfete a pele com um algodão coberto com 70% de etanol. Aplique pressão na ponta da cauda com um algodão ou gaze, conforme necessário.
   NOTA: Esse procedimento é realizado sob um capuz de armário de biossegurança. Um corte da cauda de aproximadamente 1/8 de polegada é suficiente.
4. Para identificar filhotes dentro dos grupos controle e infectado, use uma seringa de insulina de 1 mL com uma agulha permanente de 28 G x 1/2'' para tatuar as caudas dos filhotes. Antes de tatuar, desinfete a pele com um algodão coberto com 70% de etanol. Esse procedimento é realizado sob um capuz de armário de biossegurança.
5. Para tatuar a cauda, aplique tinta de tatuagem de animais na ponta da agulha. Em seguida, prenda cuidadosamente o filhote com uma mão, com o rabo totalmente exposto. Insira a agulha suavemente sob a pele, mantendo um nível superficial de profundidade, e mova a agulha paralelamente à pele por alguns milímetros até que uma pequena marca, ou ponto, seja criada. Espere alguns segundos antes de remover lentamente a agulha debaixo da pele, para evitar que o excesso de tinta seja liberado por baixo da pele.
6. Aplique pressão na ferida com um algodão ou gaze, conforme necessário. Remova o excesso de tinta de tatuagem na superfície da pele com 70% de etanol.
7. Repita esse processo com camundongos subsequentes nos grupos infectado e controle, adicionando um ponto adicional com cada filhote tatuado (por exemplo, o filhote 1 terá 1 ponto na cauda, o filhote 2 terá dois pontos na cauda, etc.).
   NOTA: Para uma camada adicional de identificação, recomenda-se usar cores separadas de tinta de tatuagem animal para os grupos controle e infectado.

3. Inoculação subescapular

NOTA: Para este estudo, foram realizados 2 experimentos com grupos de baixa dose e alta de dose designados para cada experimento. No primeiro experimento, 7 filhotes receberam o inóculo de baixa dose (4 filhotes foram usados como controles), e 5 filhotes de uma ninhada separada receberam a dose alta (3 filhotes foram usados como controles). Os filhotes do experimento 1 forneceram dados apenas para o ponto de tempo de 24 horas. No segundo experimento, 8 filhotes receberam o inóculo de baixa dose (2 filhotes foram usados como controles) e 6 filhotes receberam o inoculo de alta dose (2 filhotes foram usados como controles). Filhotes do experimento 2 forneceram dados para os pontos de 0, 10 e 24 horas.

1. Filhotes de igualdade de idade ≤ 1 dia. Atribua cada ninhada como uma ninhada de baixa ou alta dose. Dentro de uma ninhada, designe aleatoriamente os filhotes como controle ou como filhotes infectados.
2. No dia 3 ou 4 pós-natal, registre o peso de todos os filhotes antes da inoculação com E. coli-lux ou o controle PBS. Separe a mãe dos filhotes durante esse período para garantir que eles não sejam movidos durante a infecção.
3. Dentro de um gabinete de biossegurança usando uma agulha de insulina, aspire PBS ou o inóculo de E. coli-lux . Para este trabalho, foram usados inóculos de 2 x 10⁶ e 7 x 10⁶ CFUs por camundongo. Mantenha tanto o inóculo infeccioso quanto o PBS no gelo até a administração por injeção subescapular.
4. Coloque o recém-nascido sobre uma superfície limpa dentro do capuz do armário de biossegurança e eleve a pele na nuca, como se fosse acariciar o filhote.
5. No espaço agora criado entre a pele e o músculo do animal, insira a agulha, ajuste o chanfro para cima, logo abaixo da pele, e injete 50 μL de PBS ou E. coli-lux. Simultaneamente, libere a parte da pele comprimida para evitar o retorno da injeção.
6. Remova a agulha lentamente e com cuidado. Coloque os filhotes de volta com as mães após as injeções. NOTA: Devido ao estágio anatômico no desenvolvimento, é tecnicamente desafiador administrar uma veia caudal ou injeção intraperitoneal em filhotes neonatais entre os dias 3 e 4. Assim, a rota da infecção subescapular foi escolhida para este estudo devido à facilidade de execução.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 mL de Seringa de Insulina	Coviden	1188128012	Injeção de inoculo ou PBS
Pasta de Tinta para Tatuagens de Animais	Ketchum	KI1482039	Identificação animal
Pasta verde de tinta para tatuagens de animais	Ketchum	KI1471039	Identificação animal
Escherichia coli O1:K1:H7	ATCC	11775
Escherichia coli O1:K1:H7-lux (expressa luciferase)	N/A	N/A	Construído internamente na WVU
DPBS, 1X	Corning	21-031-CV
Ágar de Soja Tripco Difco	Becton, Dickinson e Companhia	236950	Crescimento bacteriano
Software IVIS Spectrum CT e Imagem Viva 4.5	Perkin Elmer	N/A	Imagem intravital
LB Broth, Lennox	Biorreagentes Fisher	BP1427-500	Crescimento bacteriano