Detecção In Situ de Bactérias em Seções de Tecido Gengival de Camundongos

Resumo

Fonte: Choi, Y. S., et al. Detecção in situ de bactérias em tecidos embutidos em parafina usando uma sonda de DNA marcada com digoxina direcionada ao rRNA 16S. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra a detecção in situ de bactérias em seções de tecido gengival de camundongos usando sondas de DNA marcadas com digoxinas direcionadas ao DNA bacteriano. A seção é incubada com a sonda. Anticorpos conjugados com fosfatase alcalina específicos da digoxina são adicionados. Fosfatases endógenas são inativadas, e um precipitado colorido é obtido pela adição de substrato. A seção é contra-tingida, desidratada, eliminada em xileno e montada antes da visualização microscópica das bactérias.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo amostras de animais foram revisados e aprovados pelo comitê de ética animal apropriado.

1. Preparação da Sonda

1. Amplificação por PCR da sonda
   1. Para a sonda específica de Porphyromonas gingivalis, amplifique um fragmento de DNA de 343 pb do rRNA 16S de P. gingivalis por PCR usando o DNA genômico de P. gingivalis e os seguintes primers: 5'- TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3' e 5' - ACT CGT ATC GCC CGT TAT TC-3'. Realize amplificações com as seguintes condições de ciclo: 35 ciclos a 95 °C por 30 s, 60 °C por 30 s e 72 °C por 1 min 20 s, seguidos por uma extensão de 5 min a 72 °C.
   2. Amplificar a sonda eubacteriana usando um fragmento de DNA de 70 pb (5'-CAGGTGCTGCATGGCTGTGTCGTCAGCTCGTGTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCCCGCGCGCGCGCGCGCGCGCCCAACCCC-3') sintetizado como oligonucleotídeo e os seguintes primers: 5'-CAG GTR CTG CMT GGY-3' e 5'-AGG GTT GCG CTC GTT-3'. Realize amplificações com as seguintes condições de ciclo: 40 ciclos a 94°C por 30 s, 60 °C por 30 s e 72 °C por 1 min 20 s, seguidos por uma extensão de 5 min a 72 °C.
   3. Precipite os produtos da PCR (≥500 μl) adicionando 3 M de acetato de sódio (pH 5,2) e 100% de etanol (na proporção 10:1:2) e incubando a -20 °C por 2 horas.
   4. Centrifuge a mistura a 14.000 x g por 15 minutos, ressuspenda o pellet em 100 μl de ácido tetraacético Tris-etilendediamina (EDTA) ou tampão TE, e meça a concentração de DNA pela densidade óptica em 260 nm.
2. Marcagem de digoxigenina (DIG) usando um kit de marcagem e detecção de DNA DIG
   1. Misture 3 μg da sonda com água até um volume final de 15 μl.
   2. Desnature o DNA a 95 °C por 10 minutos e resfrie rapidamente no gelo.
   3. Adicione 2 μl de mistura 10x hexanucleotídeos, 2 μl de mistura de marcação de trifosfato desoxinucleosídico (dNTP) e 1 μl da enzima Klenow a 15 μl do DNA desnaturalizado.
   4. Misture e incube a 37 °C por 24 horas a 48 horas, e interrompa a reação aquecendo a 65 °C.
3. Verifique a sensibilidade da sonda marcada com DIG usando um kit de marcagem e detecção de DNA DIG
   1. Carregue manualmente 1 μl de diluições seriadas da sonda de controle positivo fornecida no kit e 1 ng da sonda rotulada com DIG na membrana de náilon e sece por 5 minutos em temperatura ambiente (RT).
   2. Deixe a membrana de molho em 2x tampão de soro fisiológico e citrato de sódio (SSC) (0,3 M cloreto de sódio ou NaCl, 30 mM citrato de sódio, pH 7,0) e incube a membrana a 80 °C por 1 hora para imobilizar o DNA.
   3. Deixe a membrana de molho breve em tampão de ácido maléico (MAB, 0,1 M ácido maléico, 0,15 M NaCl, pH 7,5) e incube com anticorpo conjugado com fosfatase alcalina (AP) anti-DIG diluído (1:5.000) em 6 ml de solução bloqueante fornecida no kit em RT por 30 minutos.
   4. Lave a membrana com MABT (MAB contendo 1% Tween 20) e aplique 40 μl da solução nitro-azul tetrazolio/5-bromo-4-cloro-3'-fosfato de indolil (NBT/BCIP) misturada com 2 ml de tampão de detecção (0,1 M tris(hidroximetil)aminometano cloridrato ou Tris-HCl, 0,1 M NaCl, 0,05 M cloreto de magnésio ou MgCl₂, pH 9,5) sobre a membrana por 1 min. Se a sensibilidade da sonda rotulada não for satisfatória, repita os passos de 1.1.3 a 1.3.4.
   5. Meça a concentração de DNA da sonda marcada (OD₂₆₀) e ajuste a concentração para 100 ng μl-1.
4. Verifique a especificidade da sonda rotulada com DIG
   1. Desnaturalizar amostras de DNA genômico (25 ng 3 μl-1 por amostra) de várias espécies bacterianas, incluindo a bactéria alvo da sonda específica, a 95 °C por 10 minutos e resfriar rapidamente no gelo.
   2. Coloque manualmente o DNA desnaturado na membrana de náilon e seco por 20 minutos em tempo de descanso.
   3. Deixe a membrana de molho brevemente em 2x tampão SSC e incube a membrana a 80 °C por 2 horas para imobilizar o DNA.
   4. Bloqueie a membrana com uma solução bloqueante no RT por 1 hora.
   5. Dilua a sonda a 1 ng μl-1 em um tampão de hibridização, desnature as sondas diluídas e aplique-as sobre a membrana.
   6. Incube a membrana a 45 °C por 1 hora.
   7. Lave a membrana três vezes com 2x SSC buffer.
   8. Deixe a membrana de molho brevemente em MAB.
   9. Incubar com anticorpos conjugados anti-DIG AP diluídos (1:2.000) em 6 ml de solução bloqueante na RT por 1 hora.
   10. Lave a membrana com MABT e aplique 40 μl da solução NBT/BCIP misturada com tampão de detecção de 2 ml.
   11. Quando a sonda não atingir a especificidade esperada, aumente a temperatura de hibridização até que a especificidade seja observada.

2. Hibridização In Situ

Nota: Para evitar o secamento das amostras e reagentes, realize todas as incubações em uma câmara umidificada revestida com papel toalha úmido.

1. Desparafinização e reidratação de seções de tecido
   1. Prepare seções de tecido com 4 μm de espessura a partir de blocos embutidos em parafina. Formalina, paraformaldeído e fixador à base de zinco são compatíveis com esse protocolo.
   2. Prepare todos os reagentes usando água tratada com pirocarbonato de dietílico (DEPC).
   3. O aquecimento é deixado em um forno seco a 60 °C por 30 minutos e os slides de incubação em RT por 30 minutos.
   4. Imerga os slides em xileno 100% por 5 minutos e três vezes; Use xileno fresco toda vez.
      Nota: Faça esse procedimento de desceramento em uma exaustão química.
   5. Imerga as lâminas em etanol 100% por 5 minutos duas vezes, usando etanol fresco a cada vez, e reidrate amostras em soluções seriadas de 90%, 80% e 70% de etanol por 5 minutos cada.
   6. Imerga os lâminas em água tratada com DEPC por 1 minuto e lave as lâminas em soro tampão fosfatado tratado com DEPC ou PBS (pH 7,4) por 6 minutos.
2. Pré-tratamentos de seções de tecido
   1. Imerga os slides em ácido clorídrico 0,1 N por 20 minutos e lave os slides em água tratada com DEPC por 30 s.
   2. Desenhe uma barreira hidrofóbica ao redor dos espetáculos usando uma caneta de cera.
      Nota: O tamanho da barreira hidrofóbica depende do tamanho dos exemplares. Portanto, os volumes de reagentes usados nas etapas seguintes variam dependendo do tamanho das amostras, mas precisam preencher a barreira hidrofóbica (50 μl para amostras pequenas e 400 μl para amostras grandes).
   3. Trate amostras com 50 a 400 μl de proteinase K (1 a 10 μg ^ml-1 em PBS tratado com DEPC) em forno seco a 37 °C por 30 minutos e lave as lâminas em PBS tratado 1x por 1 minuto.
   4. Deixe as lâminas de molho em paraformaldeído a 4% em PBS tratado com DEPC por 10 minutos, depois lave as lâminas em PBS tratado com DEPC por 1 min.
   5. Deixe de molho as lâminas em 0,1 M trietanolamina-HCl (pH 8,0) contendo 0,5% de anidrido acético por 20 minutos e lave as lâminas em água tratada com DEPC por 30 segundos.
3. Hibridização com a sonda e lavagem
   1. Imerga slides em 2x SSC buffer por 20 minutos.
   2. Dilua a sonda a 1 ng ^μl-1 em tampão de hibridização (4x SSC, 50% [vol/vol] formamida, 1x solução de Denhardt, 10% [wt/vol] sulfato de dextrano, 0,1% [wt/vol] dodecil sulfato de sódio, 0,4 mg ml de DNA de espermatozoide de salmão). Para controles negativos, misture a sonda marcada com uma quantidade excessiva de 10 vezes mais de sonda não marcada.
   3. Desnature as sondas diluídas e aplique de 50 a 400 μl em seções de tecido. Coloque uma capa de cobertura no ferrolho e sele com esmalte.
   4. O calor é transferido na máquina de PCR a 90 °C por 10 minutos e os slides de incubação em uma câmara umidificada durante a noite (O/N) a 45 °C ou temperatura ótima determinada na etapa 1.4.11.
   5. Resfrie os slides a 4 °C por 30 min, remova as tampas e imerga os slides em um buffer SSC serial da seguinte forma: 4x SSC por 10 min, pré-aquecido (45 °C), 2x SSC por 20 min, 2x SSC por 10 min e 0,2x SSC por 10 min.
4. Detecção com anticorpo conjugado anti-DIG AP
   1. Lave as lâminas em MABT por 5 minutos.
   2. Bloqueie com 50 a 400 μl de solução bloqueante com 1% de Tween 20 por 20 minutos.
   3. Adicione de 50 a 400 μl de anticorpos anti-DIG-AP diluído em solução bloqueante (1:1.000) e incube a 37 °C por 90 minutos.
   4. Lave as lâminas em MABT por 10 minutos.
   5. Imerga slides em buffer de detecção contendo 1% Tween 20 por 5 minutos.
   6. Trate com 50 a 400 μl de 1 mM levamisolo (em um tampão de detecção contendo 1% Tween 20) por 5 minutos para inativar a fosfatase alcalina endógena.
   7. Distribua de 50 a 400 μl da solução pré-misturada de NBT/BCIP (diluída em buffer de detecção em 1:100) em cada amostra e incube as lâminas em uma câmara umidificada em RT por 2 a 3 horas até que o sinal desenvolvido seja satisfatório.
   8. Enxágue as lâminas com água desionizada para interromper a visualização e aplique de 50 a 400 μl de verde metilo 0,05% [wt/vol] como contra-coloração a 37 °C por 10 minutos.
   9. Enxágue as lâminas com água desionizada, desidrate em 100% etanol e imerga em xileno.
   10. Aplique 80 μl de solução de montagem em cada lâmina e tampa com varas de tampo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anidrido acético	Sigma	6404
Solução de sulfato de Dextrano 50%	Millipore	S4030
A solução de 50X Denhardt	Sigma	D2532
Pirocarbonato de dietílico (DEPC)	Sigma	P159220
Kit de marcagem e detecção de DNA com digoxigenina (DIG)	Roche	11 093 657 910
Formamida	Sigma	F9037
Caneta ImmEdge™	Dako	H-400
Levamisole	Vetoral	SP-5000
Cloreto de magnésio	Sigma	246964
Ácido maléico	Sigma	M0375
Verde de metilo	Sigma	M6776
Paraformaldeído	Sigma	P1648
Permount	Fisher	SP15-500
Solução de DNA de espermatozoides de salmão	Invitrogen	#15632-011
Cloreto de sódio	Sigma	S9625
Citrato de sódio	Duksan	D1420
Dodecilsulfato de sódio	Amresco	227
Trietanolamina-HCl	Sigma	90279
Tris-HCl	Orgânicos de pesquisa	3098T