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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.
Visualização da Infecção por Bioluminescência
- Para visualizar o progresso da infecção, inserir um operon bioluminescente cromossômico (luxCDABE) nas cepas de Pseudomonas aeruginosa PGN5 e VE2 testadas. Os plasmídeos e o protocolo usados para marcar essas cepas foram desenvolvidos no laboratório Schweizer e podem não ser compatíveis com todas as espécies/cepas de bactérias. Importante, a visualização da infecção é opcional; assim, a inserção genômica desse operon não é necessária para realizar o estudo de mortalidade.
- Prepare e valide as cepas. Além disso, verifique a bioluminescência em cepas marcadas a cada etapa de validação.
- Após preparar as cepas, injete os animais em grupos de 10 com as cepas bioluminescentes seguindo os passos acima.
- Fotografe os animais a cada 3 horas por 24 horas usando um sistema de imagem animal capaz de bioluminescência.
- Primeiro, prepare o imager ajustando os parâmetros da câmera e aquecendo o palco para os animais. Depois, ajuste o fluxo de oxigênio para 1,5 L por minuto (ou siga as recomendações do fabricante).
- Após a estabilização do imageador e do estádio, coloque um camundongo na câmara de anestesia imediatamente após a injeção e administre isoflurano a 3,5% na câmara com fluxo deO2 por cerca de 4 minutos. Os métodos de anestesia podem variar dependendo da câmara e/ou do agente anestésico utilizado; Siga as recomendações do fabricante. Determine a anestesia adequada por meio do teste de reflexo de abstinência.
- Mova o mouse para a etapa estabilizada por temperatura. Posicione o camundongo de costas com os braços estendidos e coloque um cone nariz para administração de 2,5% de isoflurano durante todo o procedimento de imagem.
- Feche a porta e tire imagens bioluminescentes e raios-X do rato.
- Quando a imagem estiver concluída, retorne o rato à sua gaiola e monitore-o. O rato deve recuperar a consciência em 3-5 minutos.
- Continue a fotografar os camundongos a cada 3 horas por 24 horas, cada vez usando um mouse diferente de cada grupo. Não refaça a imagem de um camundongo em até 24 horas devido à possibilidade de efeitos adversos ao reexposição à anestesia. Um único camundongo deve receber apenas uma dose de anestesia a cada 24-36 horas. Limpe a plataforma de imagem após cada imagem do mouse. Desligue o imageador entre os pontos de tempo da imagem.
NOTA: A bioluminescência vai desaparecer, independentemente da cepa injetada. A intensidade e a longevidade da bioluminescência variam dependendo de muitos fatores, incluindo o número de bactérias injetadas, a cepa de camundongo, a cepa bacteriana, etc.