Visualização da Infecção do Trato Urinário em um modelo de camundongo usando bioluminescência

Resumo

Fonte: Luyts, N., et al. Acompanhamento longitudinal de infecções do trato urinário e seu tratamento em camundongos usando imagem por bioluminescência. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra a indução e o rastreamento da infecção do trato urinário em um modelo camundongo usando E. coli bioluminescente injetada na bexiga, onde ocorrem adesão, invasão bacteriana e replicação intracelular. A luz emitida pelo operon bioluminescente serve como marcador em tempo real da carga bacteriana durante a progressão da infecção.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Inoculação dos animais

1. Preparação dos animais
   1. Escolha a(s) cepa(s) de camundongo desejada(s) dependendo da pergunta de pesquisa e da disponibilidade de linhas de eliminação, detalhes experimentais e diferenças na suscetibilidade às ITUs. Lembre-se que a cateterização transuretral é mais fácil em camundongos fêmeas. Não use animais com menos de 8 semanas, pois são imunologicamente imaturos. Aqui, foram usadas fêmeas de camundongos C57Bl/6J de 12 semanas.
   2. Peça os animais com bastante antecedência e deixe-os se aclimatar, idealmente por 7 dias. Agrupar animais em gaiolas ventiladas individualmente, sob condições padrão de 12 horas de luz/escuridão.
   3. Raspe a região abdominal dos animais para limitar a perda de sinal. Não use creme depilador, pois ele pode queimar rapidamente a pele dos animais. Prenda o animal segurando firmemente a barba e os membros traseiros com a mão não dominante enquanto faz a barba com a mão dominante. Alternativamente, faça a barba sob anestesia de isoflurano.
      NOTA: Os animais foram barbeados 2 dias antes da imagem, considerando que eles vão limpar ainda mais a área raspada.
   4. Forneça água e alimentos padrão à vontade durante todo o experimento. No entanto, prive os animais de água 2 horas antes da instilação para minimizar o volume da bexiga durante a instilação.
   5. Monte uma ponta estéril de 24 G de angiocateter em uma seringa de 100 μL e encha a seringa com a solução bacteriana.
      NOTA: Para determinar a luminescência de fundo, obtenha uma imagem de linha de base antes da instalação (veja o passo 2, abaixo).
2. Instilação dos animais
   1. Coloque os animais em uma câmara de indução e anestesie usando inalação de isoflurano com oxigênio puro como gás transportador (indução a 3% e manutenção a 1,5%).
   2. Coloque um animal em uma superfície de trabalho na posição supina e mantenha uma anestesia isoflurana estável usando um cone nariz durante a instilação. Aplique a pomada para os olhos.
   3. Expulse a urina residual aplicando compressão suave e fazendo movimentos circulares na região suprapúbica. Limpe a parte inferior do abdômen com etanol 70% antes da instilação.
   4. Lubrifique a ponta do cateter com soro fisiológico normal. Coloque o dedo indicador da mão não dominante no abdômen e empurre-a suavemente para cima. Inicie a cateterização da uretra em um ângulo de 90° (verticalmente) e, quando houver resistência, incline-a horizontalmente antes de inseri-la mais adiante (0,5 cm).
      NOTA: Nunca pressione o cateter com força, pois isso pode causar danos à uretra. Movimentos suaves de rotação podem ser úteis na inserção de cateter. Por outro lado, a falta de resistência geralmente indica inserção errada na vagina.
   5. Realize uma instilação lenta (5 μL/s) de 50 μL do inóculo bacteriano (2 x 10⁷ UFC).
      NOTA: Volumes maiores ou uma instilação mais rápida podem causar refluxo nos rins. Durante a prática da técnica, a tinta azul pode ser usada para avaliar o refluxo.
   6. Após a injeção, mantenha a seringa e o cateter no lugar por mais alguns segundos e depois retraha lentamente para evitar vazamentos. Registre quaisquer irregularidades, como grande vazamento ou um meato com sangue, e exclua animais, se necessário.
   7. Posicione o animal na posição supina no cone do nariz da câmara de imagem e repita os passos anteriores 1.1.1-1.1.6 para todos os animais restantes. Use um cateter por grupo experimental. Garanta que a anestesia continue e minimize o tempo entre o primeiro e o último animal.
   8. Se necessário, administre antibióticos ou medicamentos experimentais antes ou depois da imagem (passo 2). Por exemplo, para administrar enrofloxacina, adicione 40 μL da solução de enrofloxacina (100 mg/mL) a 3,96 mL de soro fisiológico para obter uma diluição de 1/100. Injete 100 μL/10 g por via subcutânea às 9h e às 17h para administrar 10 mg/kg de enrofloxacina duas vezes ao dia por 3 dias.

2. Imagem por bioluminescência

1. Preparação e seleção dos parâmetros de imagem
   1. Abra o software de aquisição BLI (veja Tabela de Materiais) e clique em Inicializar no dispositivo de imagem (veja Tabela de Materiais) para testar o sistema de câmera e controlador de palco e resfriar a câmera CCD a -90 °C.
      NOTA: Durante esse processo, a porta é trancada e o progresso da inicialização pode ser acompanhado no painel de controle. Uma luz verde indica que a temperatura de -90 °C foi atingida. Um aviso aparecerá se a imagem for tentada antes da conclusão da inicialização.
   2. Garanta que os dados sejam salvos automaticamente: Clique em aquisição Salvar automaticamente e selecione a pasta correta.
   3. Selecione Luminescência e fotografe. Verifique as configurações padrão de luminescência: Defina o filtro de excitação para Bloqueio e o filtro de emissão para Aberto.
   4. Ajuste o tempo de exposição para Auto ao tirar a primeira imagem, especialmente ao esperar um sinal fraco, para garantir um número adequado de contagem de fótons. Para medições in vivo e sinais brilhantes, defina o Tempo de Exposição para ~30 s. Se a imagem estiver saturada, um aviso aparecerá. Se isso acontecer, reduza o tempo de exposição.
   5. Selecione o Binning médio, F/stop 1, e escolha o campo de visão correto (FOV) (D para 5 animais).
   6. Ajuste a altura do sujeito para 1 cm ao fotografar camundongos.
   7. Clique em Adicionar três vezes no Painel de Controle de Aquisição para obter uma sequência de três imagens, conforme as replicações técnicas.
2. Imagem
   1. Coloque camundongos na câmara de imagem na posição supina e use o cone nadal do manifold para manter a anestesia (isoflurano 1,5%) durante todo o experimento. Fotografe até 5 camundongos simultaneamente e separe os animais usando o defletor de luz para evitar reflexos.
   2. Feche a porta e clique em Adquirir para iniciar a sequência de imagem.
   3. Preencha informações detalhadas sobre o experimento (animais selvagens e nocauteadores, tratamentos, dia da imagem, etc.). As configurações de imagem, como o tempo de exposição, são salvas automaticamente.
   4. Retire os camundongos da câmara de imagem e os coloque de volta na gaiola. Verifique a recuperação completa após a anestesia. Em poucos minutos, os animais devem estar totalmente acordados e exploradores. Não forneça analgésia, pois isso pode interferir no curso da infecção urinária.
   5. Retorne as gaiolas aos suportes ventilados até o próximo ciclo de imagem. Após a conclusão do experimento, eutanasia dos animais por asfixia por CO₂ ou luxação cervical. Faça isso antes da recuperação da anestesia de isoflurano para minimizar o sofrimento

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Vaporizador de anestesia	Aparato de Harvard Limitado	N/A	https://www.harvardapparatus.com/harvard-apparatus-anesthetic-vaporizers.html
Baytril 100 mg/mL	Bayer	N/A	Enrofloxacina
BD Insyte Autoguard 24 GA	BD	382912	Angiocateter amarelo, use ponta plástica estéril para a instalação
Mouses C57Bl/6J	Janvier	N/A
Centrífuga 5804R	Eppendorf	EP022628146
Dropsense 16	Laboratórios Desencadeados	Tríneo	para medir OD 600nm
Soro Tamponado de Fosfato da Dulbecco, Gibco	ThermoFisher Scientific	REF 14040-083
Etanol 70% desnaturado 5L	VWR internacional	85825360
Falcon 14ml Tubo de Poliestireno com Fundo Redondo, Snap-Cap	Corning	352057
Falcon 50ml cellstart	Greiner	227285
Seringa Hamilton GASTIGHT, PTFE Luer lock, 100 μL	Sigma-Aldrich	26203	para garantir uma instilação bacteriana lenta de 50 μL
Anilha de inoculação	Roth	6174.1	portador: Art. Nº 6189.1
Iso-Vet 1000mg/g	Produtos Dechra Veterinary	N/A	Isoflurano
Sistema de Imagem In Vivo do Espectro IVIS	PerkinElmer	REF 124262	Dispositivo de imagem