Preparação de Cultura de Agrobacterium para entrega de genes em células vegetais

Resumo

Fonte: Shi, J., et al., Triagem e Identificação de Supressores de Silenamento de RNA de Efetores Secretados de Patógenos Vegetais. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o procedimento para preparar uma cultura de Agrobacterium tumefaciens induzindo a expressão gênica de virulência com acetosiringona, seguida pela remoção do antibiótico por lavagem e ressuspensão, para gerar uma suspensão pronta para transformação e entrega de genes nos tecidos vegetais.

Protocolo

1. Preparação da cultura de Agrobacterium para infiltração

1. Escolha uma colônia positiva da placa Luria-Bertani (LB) e inocule as células em um tubo de vidro contendo 5 mL de meio LB suplementado com 50 μg/mL de canamicina e 50 μg/mL de rifampicina. Cultive as células a 30 °C com agitação a 200 rpm por 24−48 horas.
2. Transfira 100 μL de cultura para 5 mL de meio LB suplementado com os mesmos antibióticos, 10 mM de ácido etanossulfônico 2-(N-morfolino) (MES; pH 5,6) e 20 μM acetosiringona (AS). Cultive bactérias a 30 °C com agitação a 200 rpm por 16−20 horas.
3. Centrifuge as células a 4.000 x g por 10 minutos. Despeje o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 2 mL de buffer de 10 mM MgCl₂ .
4. Repita o passo 1.3 para garantir a remoção completa dos antibióticos.
5. Determine a densidade da cultura de Agrobacterium medindo a densidade óptica em 600 nm (OD₆₀₀). Ajuste para um OD₆₀₀ de 1,5−2,0 com 10 mM de_{MgCl 2} de buffer.
6. Adicione 10 mM de MES (pH 5,6) e 150 μM de AS às culturas finais em suspensão e incube as células em RT por pelo menos 3 horas sem agitação.
   NOTA: Não deixe as culturas finais de suspensão durante a noite.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ácido 2-Morfolinoetanosulfônico (MES)	Biofroxx	1086GR500	Buffer
Acetosiringona (AS)	Sigma-Aldrich	D134406-5G	Indução do Agrobacterium
Agar	Sigma-Aldrich	A1296-1KG	LB Medium
Bacto Triptona	BD em Biociências	211705	LB Medium
Extração de Levedura de Bacto	BD em Biociências	212750	LB Medium
Sulfato de Canalicina	Sigma-Aldrich	K1914	Antibióticos
Rifampicina	MP Biomédicos	219549005	Antibióticos
Cloreto de sódio	Amresco	0241-10KG	LB Medium