Preparação de Tecido da Bexiga de Camundongo para Visualização de Infecção Bacteriana

Abstract

Fonte: O'Brien, V. P., et. al., Infecção Urinária Recorrente de Escherichia coli Desencadeada pela Exposição à Bexiga Vaginalis por Gardnerella vaginalis em Camundongos. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o uso da microscopia eletrônica de varredura para visualizar a colonização bacteriana e as interações hospedeiro-patógeno no epitélio urinário de um modelo de camundongo pré-infectado.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê local de cuidados com animais institucionais e pelo conselho veterinário JoVE.

1. Imagem de bexigas por microscopia eletrônica de varredura

   NOTA: Esse procedimento pode ser realizado a qualquer momento em que se desejasse visualizar o urotélio. Como indicado na Figura 1 (caixas roxas), as interações uropatogênicas entre E. coli (UPEC) e uroteliais são melhor visualizadas entre 6 h e 24 h após a inoculação UPEC durante a fase de formação do reservatório, e a esfoliação urotelial desencadeada por Gardnerella vaginalis é melhor visualizada entre 3 h e 12 h após a segunda exposição a G. vaginalis .

   1. Fixação in situ da bexiga
      1. Prepare o fixador imediatamente antes da colheita na bexiga, adicionando glutaraldeído (2,5% final) e paraformaldeído (2% final) em 0,15 M de tampão cacodilato de sódio com 2 mM de_{CaCl 2} a pH 7,4. Use paraformaldeído e glutaraldeído de ampolas de vidro recém-abertas, pois ambos os fixadores oxidam com o tempo em recipientes abertos. ATENÇÃO: O glutaraldeído é tóxico, irritante respiratório e corrosivo; O paraformaldeído é inflamável, cancerígeno, um irritante e uma toxina reprodutiva; O cacodilato de sódio é tóxico e cancerígeno.
      2. Para produzir 50 mL de solução fixativa, adicione 6,25 mL de paraformaldeído a 16%, 2 mL de glutaraldeído a 50% e 16,75 mL de água ultrapura a 25 mL de uma solução 0,3 M de cacodilato de sódio a pH 7,4 com 4 mM de_{CaCl 2}.
      3. Aqueça o fixador preparado a 37 °C antes de aplicar nas bexigas.
      4. Encha a seringa de ponta deslizante da tuberculina com fixador e fixe um cateter na extremidade, biselando para as marcas opostas da seringa. Corte o excesso de tubo a 1-2 mm da ponta da agulha, tomando cuidado para não expor a ponta da agulha. Toque a seringa para remover as bolhas e empurre o êmbolo para vazar ar e encha o cateter com fixador sobre um tubo microcentrífuga para coletar qualquer fixador e descarte adequado.
      5. Anestesie e sacrifica o camundongo usando um método aprovado (por exemplo, luxação cervical sob anestesia). Coloque o rato na superfície de dissecação com as pernas seguras (com elásticos ou pinos). Abra a área pélvica do rato com pinças e uma tesoura cirúrgica para expor a bexiga. Empurre cuidadosamente a gordura adjacente para o lado, mas deixe a bexiga no lugar.
      6. Segure a seringa com a mão dominante, com a agulha apontando para baixo e as marcas do bisel da agulha e da seringa voltadas para longe de você. Mergulhe a ponta do cateter em lubrificante estéril.
      7. Posicione a ponta do cateter na abertura uretral, mantendo o cano da seringa afastado em um ângulo de 30-45° sobre o corpo do camundongo.
      8. Aplique pressão para baixo usando um movimento muito pequeno no sentido horário com a ponta e insira suavemente o cateter na uretra. À medida que a ponta do cateter entra na uretra, dobre-se a seringa em direção à cauda do camundongo enquanto continua deslizando o cateter para dentro da uretra até que o corpo da seringa fique paralelo à superfície de trabalho. Todo o eixo da agulha do cateter (excluindo a base) deve entrar no mouse, posicionando a ponta do cateter dentro do lúmen da bexiga.
      9. Administre lentamente 50-80 μL de fixador, fazendo a bexiga inflar como um balão. Mantenha o cateter no lugar e levante levemente a seringa, inclinando a ponta para cima.
      10. Com a outra mão, abra um hemostado e deslize um dos pinos sob a agulha do cateter na interseção da uretra. Feche parcialmente o hemostado até que ele faça contato com a agulha.
      11. Deslize suavemente a agulha do cateter para fora da bexiga enquanto simultaneamente aperta e trava completamente o hemostado para evitar a perda do fixador.
      12. Segure o hemostado de modo que fique paralelo à superfície de trabalho, com a bexiga apoiada em cima. Levante delicadamente e corte cuidadosamente sob o hemostado (lado oposto da bexiga) para remover a bexiga com o hemostado ainda preso.
      13. Coloque a bexiga e o hemostat anexado em um tubo Falcon contendo o fixador aquecido. Certifique-se de que a bexiga esteja totalmente submersa no fluido e não pressionada contra as paredes do tubo. Incube a 4 °C por 24 horas.
   2. Processamento e imagem da bexiga com microscopia eletrônica de varredura (SEM)
      1. Corte a bexiga sagitalmente ao meio com uma lâmina de barbear dupla e limpa e faça um segundo corte tangencial ao hemostado para liberar a bexiga. Isso resulta em 2 "copos" de meia-bexiga. Se houver alguma almofada de gordura restante na parte externa da bexiga, remova-a suavemente.
      2. Enxágue as metades da bexiga três vezes (10 min cada) em tampão cacodilato de sódio (0,15 M, pH 7,4).
      3. Tinga o tecido com tetróxido de ósmio a 1% em um tampão cacodilato de 0,15 M por 1 h em temperatura ambiente. O ósmio é sensível à luz; Portanto, realize essa etapa com o recipiente de tingimento envolto em papel alumínio para manter um ambiente escuro. ​
         ATENÇÃO: O tetróxido de ósmio é tóxico e corrosivo para a pele. Faça essa etapa na exaustão com luvas.
      4. Enxágue as metades da bexiga três vezes (10 min cada) em água ultrapura. Durante essas etapas, óleo osmicado às vezes pode ser visto na superfície da água. Aspire ou retire para evitar contaminação durante as etapas de secagem.
      5. Desidrate os tecidos submergindo em uma série de etanol graduado (50, 70, 90, 100 e 100%) por 10 minutos cada.
      6. Seque o tecido fixo usando um secador de ponto crítico, realizando trocas de 12_CO2 na velocidade mais lenta. Coloque todas as configurações adicionais em lenta, exceto a etapa de ventilação, que está configurada para rápida.
      7. Divida novamente cada metade da bexiga com uma lâmina de lâmina dupla e limpa para gerar 4 pedaços no total, reduzindo a curvatura da amostra e facilitando a imagem no MEB e expor tecido que pode ter se enrolado durante a secagem.
      8. Fixe as peças da bexiga em uma aba adesiva de carbono condutora em um toco de alumínio e pinte uma pequena quantidade de adesivo prateado ao redor do contato inferior com um palito de dente, tomando cuidado para evitar que o excesso de adesivo se espalhe pela superfície interna da bexiga.
      9. Use um revestimento de spitter de alto vácuo para aplicar 6 nm de irídio nos tocos da amostra. Se as amostras continuarem carregando, certifique-se de que um caminho condutor seja pintado até a superfície com tinta prateada e cubra mais 4 nm de irídio.
      10. Imagine as amostras com um microscópio eletrônico de varredura. Embora as condições possam variar dependendo do microscópio utilizado, uma tensão de aceleração de 3 KeV com corrente de feixe de 200 pA e distância de trabalho de 12-13 mm funcionou bem em um Zeiss Merlin FE-SEM ao usar o detector de elétrons Everhart-Thornley (SE2).

Results

Figura 1. Esquema do modelo do camundongo. A linha do tempo é destacada para refletir as fases ou procedimentos do modelo delineados no protocolo. Fase 1 (laranja): Estabelecimento de reservatórios intracelulares uropatogênicos de E. col...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
30G x 1/2 agulhas	BD	305106	Para cateteres
Hemostat de pinça reta de 5 1/2"	McKesson	487377	Fixação in situ da bexiga
Revestimento sputter ACE 600	Leica		Processamento de amostras com SEM
Stub de SEM de alumínio	Ted Pella	16111	Processamento de amostras com SEM
Cloreto de cálcio	EMS	12340	Fixação in situ da bexiga
Aba adesiva de carbono condutor	Ted Pella	16084-1	Processamento de amostras com SEM
Tinta prateada condutora	Ted Pella	16034	Processamento de amostras com SEM
Secador Crítico CPD 300	Leica		Processamento de amostras com SEM
Clipe metálico de citofunil	Simport	M964B	Urina citospun
Etanol	EMS	15050	Processamento de amostras com SEM
Glicose	Sigma	G7528	Para o meio de crescimento de G. vaginalis da NYCIII
Glutaraldeído	EMS	16320	Fixação in situ da bexiga
Kit de coloração Hema 3	Fisher	23123869	Urina citospun
HEPES	Cellgro	25-060-CL	Para o meio de crescimento de G. vaginalis da NYCIII
Irídio	Ted Pella	91120	Processamento de amostras com SEM
Merlin FE-SEM	Zeiss		Microscópio eletrônico de varredura
Purificador de Água Milli-Q	Millipore	IQ-7000	Processamento de amostras com SEM
Tetróxido de ósmio	EMS	19170	Processamento de amostras com SEM
Paraformaldeído	EMS	15710	Fixação in situ da bexiga
Tubo de polietileno	Intramédico	427401	para cateteres
Proteose Peptone #3	Fisher	DF-122-17-4	Para o meio de crescimento de G. vaginalis da NYCIII
Lâmina de barbear de lâmina dupla revestida em PTFE	EMS	72000	Cortando bexigas para MEV