<ol><li>Preparação do inóculo bacteriano<ol style='list-style-type:decimal;'><li>Estiragem de Staphylococcus aureus cepas de interesse para isolamento em placas de ágar sanguíneo a partir de um estoque de glicerol congelado. Incubar a 37 °C por 16–24 horas para confirmar fenótipos hemolíticos com base na capacidade deles de lisar glóbulos vermelhos (glóbulos vermelhos) e formar zonas transparentes e claras.</li><li>Inicie as culturas durante a noite inoculando colônias individuais de cada cepa em 4 mL de caldo de soja tríptico (TSB) em tubos de vidro estéreis. Gire os tubos a 37 °C por 16–24 horas em um rolo tubular ajustado aproximadamente em um ângulo de 70° e 70 rotações por minuto (RPM).</li><li>Use um espectrofotômetro para medir a densidade óptica a 600 nm (OD600) das culturas do passo 2.1.2. Use um meio estéril como referência óptica (em branco). Dilua essas células até um OD600 de 0,05 em 25 mL de Caldo de Soja Típtico (TSB) estéril em frascos DeLong separados de 125 mL (relação 5:1 frasco/volume) e incube as culturas em banho-maria (para transferência adequada de calor para as culturas), agitando a 280 RPM e ajustando para 37 °C. NOTA: O crescimento do inóculo pode ser realizado de várias maneiras; Um método para crescer células até uma fase exponencial é apresentado. De qualquer forma, é importante usar consistentemente o mesmo método para preparar as células para a inoculação.</li></ol></li></ol>

<table class='ck-table-resized'><tbody><tr><td>5% Sangue de ovelha</td><td>Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)</td><td>A10</td><td> </td></tr><tr><td>Banho-maria de tremor orbital</td><td>New Brunswick Innova</td><td>NA</td><td> </td></tr><tr><td>Caldo de Soja Triptico</td><td>VWR</td><td>90000-376</td><td> </td></tr><tr><td>Espectrofotômetro UV-visível</td><td>Beckman Coulter-DU350</td><td>NA</td><td> </td></tr></tbody></table>

preparando uma cultura hemolítica de staphylococcus aureus para estudos de interação hospedeiro-patógeno

Fonte: <a href='https://app.jove.com/v/59055/a-fluorescence-based-method-to-study-bacterial-gene-regulation'>Behera, R.K. et al., Um método baseado em fluorescência para estudar a regulação gênica bacteriana em tecidos infectados. J. Vis. Exp. (2019)</a>Este vídeo demonstra a preparação de culturas hemolíticas de Staphylococcus aureus para padronizar o crescimento bacteriano e alcançar a sincronização metabólica para estudos de interação hospedeiro-patógeno.

Preparando uma Cultura Hemolítica de Staphylococcus aureus para Estudos de Interação Hospedeiro-Patógeno

Source: Behera, R.K. et. al., A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues. J. Vis. Exp. (2019)This video ...

Comece com uma placa de ágar nutritiva seletiva suplementada com sangue contendo glóbulos vermelhos.Estria de Staphylococcus aureus (S. aureus), uma bactéria patogênica Gram-positiva, sobre o ágar e incuba.Durante a incubação, as bactérias utilizam nutrientes, crescem e formam colônias.S. aureus secreta hemolisina, uma toxina formadora de poros que lisa os glóbulos vermelhos no ágar e produz zonas claras e transparentes ao redor das colônias, indicativas de hemólise.Selecione uma colônia hemolítica, inocule-a em um caldo de nutrientes e incube em condições rotativas para apoiar o crescimento bacteriano.Usando um espectrofotômetro, meça a densidade óptica (OD) para determinar a concentração bacteriana.Com base na leitura do OD, transfira uma aliquota em um caldo nutritivo fresco para diluir as células e incube em banho-maria com agitação.Meça o OD em intervalos regulares.Um OD próximo a 0,8 indica que as bactérias atingiram a fase de crescimento exponencial com fisiologia uniforme.Este S. aureus hemolítico está pronto para estudos de interação hospedeiro-patógeno.Comece traçando S. Cepas de Aureus de interesse em placas de ágar sanguíneo a partir de um estoque de glicerol congelado e incubando as placas a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas para confirmar seus fenótipos hemolíticos com base em sua capacidade de lisar glóbulos vermelhos e formar zonas transparentes e claras.Inocule isolados de colônia única de cada cepa em 4 mililitros de caldo de soja tríptico, ou TSB, em tubos de vidro estéreis e gire os tubos a 37 graus Celsius por 16 a 24 horas em um rolo tubular em um ângulo de aproximadamente 70 graus e 70 rotações por minuto. Na manhã seguinte, meça a densidade óptica em 600 nanômetros, ou OD600, das culturas em um espectrofotômetro e dilua as células para um OD600 de 0,05 em 25 mililitros de TSB estéril em uma relação 5 frascos por volume em frascos DeLong de 125 mililitros. Incube as culturas em um banho-maria a 37 graus Celsius a 280 rotações por minuto.

preparing-hemolytic-staphylococcus-aureus-culture-for-host-pathogen

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Microbiology

Microbiologia

Bacterial Pathogenesis and Host Interactions

Patogênese Bacteriana e Interações com o Hospedeiro

bacterial-pathogenesis-and-host-interactions

Infection Models

Modelos de Infecção

Preparing a Hemolytic Staphylococcus aureus Culture for Host-Pathogen Interaction Studies

368 visualizações. Comece com uma placa de ágar nutritiva seletiva suplementada com sangue contendo glóbulos vermelhos.Estria de Staphylococcus aureus (S. aureus), uma bactéria patogênica Gram-positiva, sobre o ágar e incuba.Durante a incubação, as bactérias utilizam nutrientes, crescem e formam colônias.S. aureus secreta hemolisina, uma toxina formadora de poros que lisa os glóbulos vermelhos no ágar e produz zonas claras e transparentes ao redor das colôni...

Preparando uma Cultura Hemolítica de Staphylococcus aureus para Estudos de Interação Hospedeiro-Patógeno

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Nome	Empresa	Número de catálogo
5% Sangue de ovelha	Hardy Diagnostics (Santa Maria, CA)	A10
Banho-maria de tremor orbital	New Brunswick Innova	NA
Caldo de Soja Triptico	VWR	90000-376
Espectrofotômetro UV-visível	Beckman Coulter-DU350	NA