Isolamento e Cultivo de Bactérias a partir de Embriões de Peixe-Zebra para Avaliar a Carga de Infecção

Resumo

Fonte: Bernut, A., et al., Decifração e Imagem da Patogênese e Cordamento de Mycobacterium abscessus em embriões de peixe-zebra. J. Vis. Exp. (2015).

Este vídeo demonstra um protocolo para isolar e quantificar Mycobacterium abscessus de um embrião infectado de peixe-zebra. O procedimento envolve eutanásia embrionária, lise dos tecidos e homogeneização para liberar as bactérias, seguidas de centrifugação e ressuspensão em um tampão de surfactante. Por fim, a suspensão bacteriana é diluída em série, placada em ágar suplementado com antibióticos e incubada para permitir a formação e quantificação da colônia.

Protocolo

1. Preparação e Armazenamento do Inóculo de M. abscessus
   1. Condições de crescimento do M. abscessus
      1. Retirar M. abscessus de um estoque de glicerol a -80°C em um ágar Middlebrook 7H10 contendo 10% de OADC e 0,5% de glicerol (7H10OADc), suplementado com o antibiótico apropriado dependendo do marcador de resistência carregado pelo vetor que codifica a proteína fluorescente. Incube as placas a 30 °C por 4-5 dias.
      2. Pegue uma colônia de micobactérias fluorescente-positiva e inocule 1 ml de caldo Middlebrook 7H9 suplementado com OADC, 0,2% glicerol e 0,05% Tween 80 (7H9OADc/T) com o antibiótico necessário em um tubo plástico estéril de 15 ml. Incube a 30 °C por 1 semana sem tremer.
         NOTA: Pré-adolescente 80 restringe aglomerações e agregação bacteriana.
      3. Resuspenda a pré-cultura obtida em 2.1.2 em 50 ml de Middlebrook 7H9OADc/T em frascos de cultura de tecido de 150 cm2 até um OD final_{de 0,1 600} (correspondendo a cerca de 5,107 bactérias/ml) e incube ainda mais a 30 °C por 4 dias para obter uma cultura de crescimento exponencial (OD₆₀₀ = 0,6 a 0,8).
         NOTA: Para minimizar aglomerações, especialmente da variante áspera, a incubação não deve exceder 5 dias. Tanto as variantes suaves quanto as ásperas apresentam taxa de crescimento semelhante.
2. Preparação do inocula de M. abscessus
   NOTA: Devido à alta propensão do abscesso áspero de M . a formar grandes agregados e produzir cordões, é necessário um tratamento específico para gerar unóculos homogêneos e controlados quantitativamente antes das microinjeções nos embriões. Esse tratamento também é aplicado a bactérias lisas que produzem agregados, embora em menor grau do que a cepa áspera.
   1. Colhe culturas de crescimento exponencial a partir de frascos de cultura de tecido de 150 cm² por centrifugação a 4.000 x g por 15 min em RT em um tubo plástico estéril de 50 ml e resuspenda o pellet bacteriano em 1 ml 7H9OADc/T. Aliquota 200 μl de suspensões bacterianas em tubos de microcentrífuga de 1,5 ml.
      NOTA: Trabalhar com pequenos volumes em seringas de 1 ml é necessário para obter suspensões altamente homogêneas.
   2. Homogeneize as suspensões bacterianas com uma agulha de 26 G (15 sequências de subida e descida), sonice três vezes por 10 segundos (com intervalos de 10 segundos entre cada sequência de sonicação) usando um sonicador de banho-maria. Adicione 1 ml de 7H9OADc/T e faça vórtice brevemente. Centrifuge 3 min a 100 x g.
   3. Colete cuidadosamente os supernadantes contendo micobactérias para evitar os aglomerados e agrupe as suspensões homogêneas em um tubo plástico estéril de 50 ml.
   4. Verifique visualmente a presença de agregados bacterianos remanescentes no futuro.
      NOTA: Se ainda houver agregados, prossiga para uma etapa adicional de centrifugação a 100 x g por 2 minutos e colete o sobrenadante.
   5. Centrifuge a suspensão a 4.000 x g por 5 minutos, ressuspenda o pellet em 200 μl 7H9OADc/T e prossiga para a injeção.
   6. Avalie a concentração bacteriana final por meio de placagem de diluições seriadas (em 1x PBST) em ágar 7H10OADc e contagem das unidades formadoras de colônia (CFU) após 4 dias de incubação a 30 °C. As CFUs devem ser determinadas para cada novo lote.
   7. Prepare estoques de inocula congelados armazenando alíquotas de 5 μl a -80 °C.
      NOTA: A avaliação da CFU das alíquotas congeladas de -80°C é pré-requisito para determinar o número exato de bactérias viáveis, já que o congelamento/descongelamento pode afetar a viabilidade bacteriana do inóculo. Esses inóculos congelados estão prontos para serem usados em injeções subsequentes. Como todas as aliquotas contêm o mesmo número de UFC, elas permitem injetar bactérias de forma reprodutível de um experimento para outro.
3. Controle de qualidade do inoculo
   NOTA: A coloração Ziehl-Neelsen (específica para micobactérias) pode ser usada para comparar a qualidade das suspensões bacterianas antes e depois dos procedimentos de homogeneização.
   1. Coloque e espalhe uma gota da suspensão bacteriana homogeneizada em uma lâmina de vidro e deixe secar completamente. Fixe a mancha por pelo menos 30 minutos em uma placa quente ajustada a 65-70 °C e tinga usando um protocolo de coloração Ziehl-Neelsen.
   2. Observe o esfregaço bacteriano com um microscópio usando uma objetiva 100X e compare com um esfregaço de uma suspensão bacteriana não processada (Figura 1).

2. Preparando embriões de peixe-zebra

1. Desova e coleta de ovos de peixe-zebra
   1. No dia anterior à desova, reproduza peixes-zebra adultos colocando 2 machos e 1 fêmea (geralmente uma proporção de 2:1 permite a taxa ideal de fertilização) em uma câmara de reprodução, composta por um aquário separado com uma cesta de coleta de ovos.
      NOTA: Cestos de coleta de ovos são usados para proteger os ovos de serem consumidos pelos pais e facilitar a colheita dos ovos.
   2. Com 1 hpf, colhe os ovos e apenas embriões devidamente desenvolvidos em uma placa de Petri de 100 mm preenchida com 25 ml de água de peixe azul (máximo 100 embriões por prato) e mantenha-os a 28,5 °C. Ovos não fertilizados são descartados.
2. Preparação de embriões de peixe-zebra para injeções
   1. Por volta de 24 horas após a fertilização (hpf), decoriione os embriões com pinças finas em uma placa de Petri de 100 mm e mantenha-os a 28,5 °C.
   2. Colete os 30-48 embriões de hpf usando uma pipeta e transfira-os para uma câmara de posicionamento em formato de "V" cheia de 25 ml de água de peixe contendo 270 mg/L de tricaína. Coloque os embriões corretamente nos canais usando uma ferramenta caseira de ponta microloader (uma ponta caseira clipada) otimizada para facilitar a micromanipulação.
      NOTA: Oriente o lado dorsal para baixo para injeções intravenosas na veia caudal ou o lado dorsal para cima para injeções no músculo caudal.

3. Procedimento de Microinjeção

NOTA: Para avaliar a cronologia da infecção por M. abscessus (sobrevivência, cargas bacterianas, cinética e características da infecção), preferem-se injeções na veia caudal de 30 embriões de HPF. Para visualizar o recrutamento de células imunes, as injeções são feitas em locais localizados, como nos músculos caudais de um embrião de 48 hpf.

1. Dilua o inóculo micobacteriano em 1X PBST (dependendo da quantidade de UFC a ser administrada), contendo 10% de fenol vermelho para verificar a injeção adequada.
2. Carregue uma agulha microcapilar com 5-10 μl do inoculo bacteriano usando uma ponta microcarregadora, conecte a agulha de microinjeção ao suporte do micromanipulador tridimensional conectado ao injetor e quebre a parte superior da agulha com pinças finas para obter um diâmetro de abertura de 5-10 μm.
3. Calibre o volume de injeção ajustando a pressão de microinjeção (20-50 hPa) e o tempo (0,2 seg).
   NOTA: O volume de injeção necessário é calibrado por determinação visual do diâmetro de uma gota expelida na gema de um embrião.
4. Para a injeção na veia caudal, posicione o embrião com o lado ventral voltado para a agulha e coloque a ponta da agulha próxima à abertura urogenital, direcionando a veia caudal, e empurra suavemente a ponta da agulha para dentro do embrião até que ele perfure a região da veia caudal. Administre o volume desejado de preparação bacteriana, geralmente de 1 a 3 ml contendo cerca de 100 CFU/nl.
5. Para a injeção intramuscular, posicione o embrião com o lado dorsal voltado para a agulha, coloque a agulha sobre um somite e injete um pequeno volume (1 nl) de inóculo.
   NOTA: Quanto às injeções na veia caudal, as injeções intramusculares também são desafiadoras de realizar. Deve-se ter cuidado para evitar sobrecarga, que pode ferir os tecidos ao redor.
6. Ao final do procedimento de injeção, controle o tamanho do inóculo injetando o mesmo volume de suspensão bacteriana em uma gota de PBST estéril, seguido pelo placagem em 7H10OADc e contagem da UFC. Cerca de 100 embriões podem ser injetados com uma agulha.
   NOTA: Como o M. abscessus áspero pode continuar formando agregados na agulha, as injeções precisam ser feitas imediatamente após a preparação do inóculo.
7. Transfira os peixes infectados individualmente para placas de 24 poços contendo 2 ml/poço de água para peixes e incube a 28,5 °C. Embriões injetados com 1-3 nl 1X PBS podem ser usados como controles.
8. A infecção adequada de bactérias fluorescentes em embriões é monitorada usando um microscópio de fluorescência.

4. Quantificação da Carga Bacteriana

1. Determinação por enumeração de CFU
   1. No momento desejado, colete grupos de embriões infectados (5 por condição) em tubos microcentrífugas de 1,5 ml (1 embrião/tubo), crio-anestesie os embriões por incubação em gelo por 10 minutos e eutanasie usando uma overdose de tricaína (300-500 mg/L)
   2. Lave os embriões com água estéril duas vezes e dispense-os em um novo tubo. Lisar cada embrião com 2% de Triton X-100 diluído em 1X PBST usando uma agulha de 26-G e homogeneizar a suspensão até a lise completa. Centrifuge a suspensão e resuspenda o pellet em 1X PBST com 0,05% Tween 80. Diluições seriadas dos homogenados são placadas em Middlebrook 7H10OADc e suplementadas com BBL MGIT PANTA, conforme recomendado pelo fornecedor.
      NOTA: M. abscessus é mais suscetível ao tratamento com NaOH do que M. marinum. A descontaminação de lisados de peixes sem afetar o crescimento do abscesso de M . pode ser alcançada com sucesso usando o coquetel antibiótico BBL MGIT PANTA.
   3. Incube as placas por 4 dias a 30 °C e conte as colônias.

Resultados

Figura 1. Preparação do inoculo disperso de M. abscessus.Coloração Ziehl-Neelsen de variantes R ou S cultivadas em meio de caldo antes de qualquer tratamento (painéis superiores) ou após o tratamento (painéis inf...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
BBL MGIT PANTA	BD em Biociências	245114
Albumina Sérica Bovina	Euromedex	04-100-811-E
Catalase do fígado bovino	Sigma-Aldrich	C40
Difco Middlebrook 7H10 Agar	BD em Biociências	262710
Caldo Difco Middlebrook 7H9	BD em Biociências	271310
Sal de metanosulfonato de etil 3-aminobenzoato (Tricaine)	Sigma-Aldrich	A5040
Ácido oleico	Sigma-Aldrich	O1008
Paraformaldeído	Microscópia Delta	15710
Phenol Red	Sigma-Aldrich	319244
Tween 80	Sigma-Aldrich	P4780
Agar	Gibco Life Technologie	30391-023
Agarose de baixa fusão	Sigma-Aldrich
Sais Marinhos Instantâneos do Oceano	Aqua Systems Inc
Capilares de vidro borosilicato	Sutter instrument Inc	BF100-78-10	1 mm de divisão externa x 0,78 mm de divisão de identificação.
Dispositivo puxador de micropipeta	Sutter Instrument Inc		Puxador de Micropipeta Flamejante/Marrom P-87
Microinjetor	Pesquisa Tritech		MicroINJECTOR digital, MINJ-D
Pinça	Sciences Tools inc		Dumont # M5S
Dicas para Microcarregador	Eppendorf