Modelagem da Patogênese de Aeromonas em C. elegans Usando um Ensaio de Sobrevivência

Resumo

Fonte: Chen, Y., et al. Avaliando a Virulência e Patogênese da Infecção por Aeromonas em um Modelo de Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra um ensaio de sobrevivência usando C. elegans para modelar a patogênese da Aeromonas , onde a ingestão oral da bactéria leva a infecção intestinal e mortalidade, possibilitando uma avaliação quantitativa da virulência bacteriana em um sistema hospedeiro vivo.

Protocolo

1. Ensaio de sobrevivência de C. elegans com Aeromonas

1. No dia da semeadura dos vermes L1 no meio de crescimento ENGM (nematoide enriquecido) que se espalham com E. coli OP50, selecione uma única colônia de cada uma das quatro cepas de Aeromonas ou E. coli OP50 e cultive com 2 mL de caldo LB, respectivamente, a 37 °C por 16 horas.
   NOTA: Para evitar contaminação, essa etapa deve ser realizada em um exaustor de fluxo laminar. Aqui, foram usadas as seguintes cepas bacterianas: E. coli OP50, a fonte normal de alimento de C. elegans. A. dhakensis AAK1, o primeiro isolado clínico patogênico totalmente sequenciado de A. dhakensis . A. hydrophila A2-066, A. veronii A2-007 e A. caviae A2-9307121 são isolados clínicos representativos do Hospital Nacional da Universidade Cheng Kung.
2. Meça a absorção do OD₆₀₀ (densidade óptica em 600 nm) do caldo bacteriano e ajuste o caldo bacteriano para OD₆₀₀ = 2,0 com LB de caldo.
3. Espalhe e espalhe 30 μL de caldo bacteriano em cada placa de 6 cm de NGM (meio de crescimento de nematoides). Cultive as placas em temperatura ambiente durante a noite.
   NOTA: Para preparar a NGM, dissolva 3 g de NaCl (cloreto de sódio), 2,5 g de peptona bacteriana e 20 g de ágar em 1 litro de água desionizada. Autoclave a 121 °C por 20 minutos. Espere até que esteja resfriado a 55 °C em banho-maria e então adicione 1 mL de 1 M_{CaCl 2} (cloreto de cálcio), 1 mL de 1 M_{MgSO 4} (sulfato de magnésio), 1 mL de colesterol a 5% em etanol e 25 mL de tampão fosfato. Gire para misturar bem.
4. No dia em que os vermes L1 crescem para o estágio L4, selecionem e transfiram aleatoriamente 50 vermes para uma placa NGM com cada uma das quatro cepas Aeromonas ou E. coli OP50.
5. Incube as placas NGM a 20 °C até que o ensaio seja concluído.
6. Transfira todos os vermes vivos para uma placa NGM recém-preparada com bactérias e conte o número de vermes vivos, mortos e sensores todos os dias até que o último verme esteja morto.
   NOTA: Transfira vermes para uma placa NGM fresca preparada todos os dias para a manutenção da infecção, mesmo usando vermes estéreis (por exemplo, glp-4 ou com FudR).
7. Plote as curvas de sobrevivência com base no cálculo diário dos dados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Incubadora shaker	YIH DER	LM-570R	Incubação de bactérias
NaCl	SIGMA	31434	Preparação do meio de cultura
MgSO₄	SIGMA	M7506	Preparação do meio de cultura
Agar	Difco	214530	Preparação do meio de cultura
CaCl₂	SIGMA	C1016	Preparação do meio de cultura
Colesterol	SIGMA	C8503	Preparação do meio de cultura
Placa de Petri de 6 cm	ALPHA PLUS	46	Preparação em placa de ágar
Peptôna bacteriana	Affymetrix/USB	AAJ20048P2	Preparação do meio de cultura
FudR	SIGMA	1271008	Preparação do meio de cultura
Sistema de microscópio	Nikon	Eclipase Ti invertida	Imagem ao microscópio